低氧运动对营养性肥胖大鼠骨骼肌PGC―1α及其下游因子的影响.doc

低氧运动对营养性肥胖大鼠骨骼肌PGC―1α及其下游因子的影响 　　摘 要：探讨低氧运动对营养性肥胖大鼠骨骼肌PGC-1α及其下游因子的影响。构建7周高脂膳食诱导SD大鼠营养性肥胖模型，建模后随机分为常氧高脂膳食安静组（NHQ）、常氧高脂膳食运动组（NHE）、16.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ1）、16.3%低氧高脂膳食运动组（HGE1）、13.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ2）、13.3%低氧高脂膳食运动组（HGE2），每组各10只。运动组进行8周耐力训练，即20 m/min、40 min/d，5 d/周。末次运动24 h后处死大鼠并采样，测定血脂4项和血糖（BG），qRT-PCR技术检测PGC-1α及其下游因子的表达（CPT-1、MCAD、PPARγ）。结果显示：1）7周高脂膳食可成功诱导营养性肥胖大鼠模型建立；2）与NHQ和HGQ1组相比，HGE1、HGE2和NHE组体质量下降非常显著或显著（P<0.01或P<0.05）；与NHE组相比，HGE1和HGE2组体质量显著性下降（P<0.05）；3）与NHQ组相比，NHE组MCAD mRNA表达非常显著性上调（P<0.01）；HGE1组PGC-1α、MCAD、PPARγ mRNA表达非常显著性增加或显著性增加（P<0.01或P<0.05）；HGQ2组PGC-1α mRNA表达非常显著性上调（P<0.01）；HGE2组PGC-1α 、MCAD、CPT-1、PPARγ mRNA表达非常显著性上调或显著性上调（P<0.01或P<0.05）。与NHE组相比，HGE1和HGQ2组PGC-1α mRNA表达显著性增加（P<0.05）；HGE2组PGC-1α 、MCAD、CPT-1、PPARγ mRNA表达非常显著性上调或显著性上调（P<0.01或P<0.05）；NHQ、HGQ1和HGQ2组MCAD mRNA表达非常显著性下降或显著性下降（P<0.01或P<0.05）。与HGQ1组相比，HGE1和HGQ2组PGC-1α、MCAD表达非常显著性上调或显著性上调（P<0.01或（P<0.05）；HGE2组PGC-1α、MCAD、CPT-1 mRNA表达非常显著性上调（P<0.01）；NHE组MCAD、PPARγ mRNA表达非常显著性或显著性增加（P<0.01或P<0.05）。结果表明：（1）长期高脂膳食可诱导营养性肥胖发生。（2）低氧和（或）耐力运动可有效控制营养性肥胖大鼠体质量，增加骨骼肌PGC-1α及其下游基因的表达，13.3%低氧浓度下耐力运动效果较佳。 　　关 键 词：运动生物化学；低氧运动；营养性肥胖；骨骼肌；过氧化物酶体增殖物受体γ共激活分子；大鼠 　　中图分类号：G804.7 文献标志码：A 文章编号：1006-7116（2016）03-0130-07 　　Abstract： In order to probe into the effects of hypoxic exercise on PGC-1α in skeletal muscle of rats with alimentary obesity and its downstream factors， the authors built a model of SD rats with alimentary obesity induced by 7-week high-fat diet， then divided the rats randomly into a normoxic high-fat diet quit group （NHQ）， a normoxic high-fat diet exercise group （NHE）， a 16.3% hypoxic high-fat diet quit group （HGQ1）， a 16.3% hypoxic high-fat diet exercise group （HGE1）， a 13.3% hypoxic high-fat diet quit group （HGQ2）， and a 13.3% hypoxic high-fat diet exercise group （HGE2）， each of which consisted of 10 rats， continued to feed the rats with high-fat food， let them undergo 8-week endurance training， i.e. 20m/min， 40min/d， 5d/week， killed and sampled the rats 24h after the last exercise， measured 4 blood lipid indexes and blood glucose （BG） by means of test kit， measured PGC-1α and its downstream factors CPT-1， MCAD and PPARγ by means of qRT-PCR technology， and revealed the following findings： 1） 7-week high-fat diet could induced the increase or significant increase of the weight， BMI， as well as BG， CHO， LDL-L and TG contents of the rats （P 　　Key words： sports biochemistry；hypoxic exercise；alimentary obesity；skeletal muscle；PGC-1α；rats 　　生活水平提高和饮食习惯改变，营养性肥胖比例逐渐升高，而肥胖伴随机体脂代谢紊乱、胰岛素抵抗等不良病征，已逐渐成为威胁人类健康的重要因素之一。骨骼肌作为机体重要运动器官，是能量代谢重要场所，其代谢稳态是维持骨骼肌健康乃至整个机体健康的基本前提与重要保证[1]。当骨骼肌中脂肪供给与氧化代谢不均衡时，脂肪代谢异常往往会导致骨骼肌中脂代谢紊乱，发生胰岛素抵抗现象。路瑛丽等[2]揭示低氧运动对肥胖大鼠骨骼肌脂肪酸氧化相关基因表达的良性影响。过氧化物酶增殖物受体γ共激活分子（PGC-1α）表达于骨骼肌、心肌、肝脏、棕色脂肪组织等能量代谢活跃的组织[3]，可调节线粒体生物发生、调控适应性产热、调控骨骼肌细胞内脂肪氧化累积等生理过程[4]。骨骼肌中肉毒碱棕榈酰转移酶1（CPT-1）和中链酰基辅酶A脱氢酶（MCAD）是调控脂肪酸合成或氧化的代谢关键酶，也是调控长链脂肪酸进入线粒体的重要酶，在脂肪酸氧化中起着重要作用，而PGC-1α可以调控CPT-1及MCAD表达[5-6]。过氧化物酶增殖物受体γ（PPARγ）介导的基因转录参与脂肪细胞分化、糖脂代谢等生理调控过程，而PGC-1α作为其转录辅激活因子，可辅助激活PPARγ的基因表达，骨骼肌糖脂代谢中发挥作用[7]。目前，在常氧状态下，耐力运动对高脂膳食大鼠骨骼肌中PGC-1α促进脂肪酸氧化作用已有所证实[8]。然而，低氧或（和）耐力运动是否影响高脂膳食大鼠骨骼肌中PGC-1α及其下游因子的表达，目前尚未见报道。本实验通过高脂膳食诱导生长期大鼠营养性肥胖模型并对其进行不同浓度低氧及运动干预，探讨不同低氧浓度及运动对大鼠骨骼肌中PGC-1α及其下游因子在其脂肪酸氧化过程的影响，旨在为代谢性疾病的低氧运动防治提供理论参考和实验依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 营养性肥胖大鼠建模及低氧运动干预分组 　　1）营养性肥胖大鼠建模。 　　清洁级健康雄性SD大鼠（SCXK（粤）2011-0015）100只，由南方医科大学实验动物中心提供，体重170～220 g。动物分笼饲养，5只/笼，自然光照节律，自由摄食、饮水，温度22～24 ℃，湿度40%～55%，普通膳食为国家标准啮齿类动物干燥饲料（南方医科大学动物实验中心提供）；高脂膳食：蔗糖20%、猪油15%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、酪蛋白10%、磷酸氢钙0.6%、石粉0.4%、预混料0.4%、基础饲料52.2%（均为质量分数）（广东省医学实验动物中心提供，SCXK（粤）2013-0002），高脂膳食供能比：蛋白质17.5%，脂肪37%，碳水化物45.5%（质量分数）。大鼠随机分为普通膳食组（CON，20只）和高脂膳食造模组（DIO，80只）。根据肥胖易感模型筛选规律，高脂膳食组大鼠的体重超过普通膳食组大鼠体重的20%即可作为营养性肥胖大鼠[9]。持续性喂养7周后，从CON组和DIO组分别随机挑选10只和18只，眼眶取血，测其血糖、血脂，结合大鼠体重、BMI，进而评价造模效果。 　　2）低氧运动干预分组。 　　营养性肥胖大鼠模型建立成功后的60只大鼠分为6组：常氧高脂膳食安静组（NHQ）、常氧高脂膳食运动组（NHE）、16.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ1）、16.3%低氧高脂膳食运动组（HGE1）、13.3%低氧高脂膳食安静组（HGQ2）、13.3%低氧高脂膳食运动组（HGE2），每组10只持续干预8周，均进行高脂膳食饲养，运动组则进行8周跑台耐力训练，适应性1周后，均以20 m/min，40 min/d，5 d/周，跑台坡度为0%，进行耐力运动。末次训练24 h后处死大鼠，大鼠主动脉取血，3 000 r/min离心15 min，取血清；另取一侧腓肠肌置液氮速冻，均于-80 ℃超低温冰箱长期保存，待测。 　　1.2 血脂、血糖测定 　　半自动生化仪测定血脂四项（南京建成公司试剂盒）：总胆固醇（COD-PAP法）、高密度脂蛋白（磷钨酸镁沉淀法）、低密度脂蛋白（聚乙烯硫酸沉淀法）、甘油三酯（GPO-PAP法）。京都血糖仪测定血糖含量（京都血糖试纸）。 　　1.3 实时荧光定量PCR测定PGC-1α及其下游基因表达 　　Trizol 法提取骨骼肌组织总RNA。取1 μg总RNA用TaKaRa公司的PrimeScript TM逆转录试剂盒进行逆转录反应获得cDNA，使用SYBR GreenⅠ荧光染料，实时荧光定量PCR（ABI 7500 型荧光定量PCR仪，美国）测定PGC-1α、CPT-1、MCAD、PPARγ mRNA表达量。扩增条件为：预变性每10 min 95 ℃；每30 s 95 ℃，60 ℃退火1 min（PGC-1α、MCAD、PPARγ和GAPDH）、CPT-1 58 ℃退火1 min，共40个循环。以GAPDH作为内参，计算目的基因的相对表达量（ 对照组的倍数） 。利用Primer 5软件设计引物，由上海生工生物公司合成的引物序列见表1。 　　1.4 数据统计 　　各检测数据录入Excel 2007，结果用平均数±标准差（ ±s），GraphPad Prism 5进行数理统计及图像生成，SPSS17.0软件进行多因素方差分析，两组之间进行独立样本t检验，以P<0.05为差异显著性水平，P<0.01为差异非常显著性水平。 　　2 实验结果及分析 　　2.1 高脂膳食诱导营养性肥胖大鼠模型建立 　　7周高脂膳食饲养后，DIO组大鼠较CON组体质量、体长、BMI均非常显著性增加（P<0.01，见表2）。 　　与CON组相比，DIO组大鼠血糖（Blood Glucose，以下简称BG）、总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL-c）均非常显著性增加（P 　　综上，7周高脂膳食饲养后，DIO组大鼠形态学变化表现为体质量、BMI、体长显著高于CON组，且体质量增长超过CON组大鼠20%；血液生化相关指标表现为BG、TC、LDL-c含量非常显著性增加；两组大鼠摄食量无显