卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFvmGM-CSF融合蛋白(精).doc

     卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv/mGM-CSF 融合蛋白的构建、表达及活性测定          【摘要】　目的　构建卵巢癌抗独特型单链抗体6B11ScFv和鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，以观察其在动物体内诱导的特异性免疫反应，为卵巢癌抗独特型疫苗应用于临床提供依据。　方法　用DNA重组技术，将mGM-CSF连于单链抗体6B11ScFv羧基末端，构建重组质粒pET30-6B11mGM，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导，以包涵体形式获高效表达，超声破碎细菌细胞获得包涵体，用8mol.L-1尿素溶解包涵体后直接稀释复性，SDS-PAGE分析蛋白纯度，ELISA分析技术和细胞增殖实验测定融合蛋白的抗体和细胞因子活性。　结果　复性蛋白纯度达90%以上。采用氧化型谷胱甘肽(GSSG)浓度为1mmol.L-1，还原型谷胱甘肽(GSH)浓度为5mmol.L-1，10℃复性48h，复性率达36%。表达的融合蛋白分别能与COC166-9单抗和大鼠抗小鼠GM-CSF单抗特异结合，并能刺激mGM-CSF依赖株NFS-60细胞增殖。　结论　以包涵体表达的融合蛋白6B11mGM保留了两种蛋白的活性，为研究融合蛋白在体内的免疫功能提供了基础。 　　【关键词】　卵巢癌；重组融合蛋白；抗体；抗独特型；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；包涵体 　　【中分类号】　R392.11　【文献标识码】　A　【文章编号】　0529-1356(2000)03-226 THE CONSTRUCTION， EXPRESSION AND ACTIVITY EXAMINATIONS OF 6B11ScFv／MURINE GM-CSF FUSION PROTEIN LIU Bei,CUI Heng?, FENG Jie, YE Xue, LI YI, CAO Shan-jin, GE Hua, FU Tian-yun, YAO Yu, QIAN He-nian (Gynecologic Oncology Center, People's Hospital, Beijing Medical University, Beijing　100044, China) 　　【Abstract】　Objective　　To construct expression vector which expresses fusion protein of antiidiotypic single chain antibody 6B11ScFv and murine GM-CSF(6B11mGM) for observing its possible immune reactions in vivo. Methods　Using DNA recombinant techniques, the murine GM-CSF cDNA gene was recombined to 6B11ScFv and they were cloned into expression vector pET-30a(+) to produce insoluble protein. Inclusion bodies collected after the breakage of bacteria through sonication were subjected to repeatedly washing. Inclusion bodies solubilized in the resence of 8 mol.L-1 urea were diluted with renaturation solutions so that folding process could be initiated. The purity was examined by SDS-PAGE, ELISA and cell proliferation assay were used to determine the activities of fusion protein. Results　6B11mGM fusion proteins were obtained with a purity of over 90%. The optimum conditions were 1mmol.L-1 and 5 mmol.L-1 for the concentrations of GSSG and GSH, respectively, with 48 hours at 10℃ as renatured time. Fusion protein could specifically react with the primary anti-ovarian carcinoma monoclonal antibody(COC166-9) and rat anti-mouse GM-CSF monoclonal antibody, respectively, and fusion proteins could also stimulate murine GM-CSF dependent cell line NFS-60 cells to proliferate. Conclusion　Fusion proteins 6B11mGM expressed as inclusion bodies can keep the activity of both the proteins and provid foundation to research the immunoreactions in vivo. 　　【Key words】　Ovarian carcinoma; Recombinant fusion proteins; Antibodies, Anti-idiotypic; Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor; Inclusion bodies 　　本中心曾用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB／c小鼠，制备了单克隆抗体COC166-9。经免疫组织化学染色证实该抗体对卵巢上皮癌具有较高的特异性［1］。继而用COC166-9单抗免疫小鼠制备了内影像型抗独特型抗体6B11。经免疫竞争抑制试验证实，该抗体具有模拟卵巢上皮癌初始抗原OC166-9的作用［2］，可在体内外诱导产生特异的抗卵巢癌免疫反应［3，4］。为了降低鼠源性抗体反复在体内应用时可能引起的副作用，本中心对卵巢癌抗独特型抗体6B11进行改造，构建了单链抗体6B11ScFv［5］。改型后的抗体，虽降低了鼠源性，但同时因分子量减少，免疫原性也随之下降，应用时必须与匙孔血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)等偶联并加用佐剂才能引起有效的免疫反应［6］，而现在常用佐剂往往对人体有害。因此，有必要寻求一种新的佐剂。最近研究表明粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)等细胞因子与抗原构成的融合蛋白，可增加抗原的免疫原性［7］。为提高单链抗体6B11ScFv的免疫原性，使其能做为卵巢癌抗独特型疫苗，本中心已构建成功6B11ScFv与人GM-CSF融合蛋白(6B11GM)，并且体外实验已证实在抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC)和树突状细胞(dendritic cell,DC)存在情况下，可诱导T细胞增殖，同时APC对6B11GM摄取明显高于单用6B11［8］。但由于目前缺乏合适的动物模型，使抗独特型疫苗的效果和机制难以得到体内实验的验证。因此，本研究构建6B11ScFv与鼠GM-CSF融合蛋白(6B11mGM)，目的在于进行体内外实验，为卵巢癌抗独特型疫苗6B11GM应用于临床打下基础。 材料和方法 1.质粒、细胞系 　　质粒pL／6B11ScFv-hGM-CSF由本中心构建。质粒pET30a(+)购自Novagen公司。质粒pTC-GM.2内含murine GM-CSF cDNA，由美国斯坦福大学Levy教授惠赠。pGEM-T Vector购自Prome-ga公司。鼠GM-CSF依赖株NFS-60细胞购自北京医科大学分子免疫学室。宿主菌E.coli BL21(DE3)购自Novagen公司。 2.抗原、抗体和细胞因子 　　卵巢浆液性乳头状癌抗原OC166-9由本中心制备。HRP-COC166-9抗体、6B11单克隆抗体均为本室制备。大鼠抗小鼠GM-CSF单抗及重组murine GM-CSF购自美国R and D System。HRP-羊抗大鼠IgG购自Santa Cluz公司。 3.试剂 　　Tag酶、T4DNA连接酶及各种DNA限制性内切酶均购自美国Promega公司。MTT等生化试剂购自北京天象人公司和北京化学试剂公司。 4.鼠GM-CSF的PCR克隆 　　鼠GM-CSF位于pTC-GM.2质粒中，由于缺乏合适的酶切位点，依据融合蛋白6B11mGM的构建策略(1～3)。利用PCR克隆技术，在mGM-CSF上、下游引物中分别引入匹配的酶(SpeI、EcoRI)切点。 　　上游引物：5′-TATACTAGTGCACCCACCC-GCTCACCCAT-3′；下游引物：5′-GGGGAATTC-TCATTTTTGGACTGGTTT-3′。为避免PCR可能产生的突变，将mGM-CSF的PCR产物，克隆入测序载体pGEM-T Vector，构建成pGEM-T／mGM-CSF。经Sanger双脱氧末端终止法测序，证实所克隆到的mGM-CSF与文献发表序列及Genebank登录序列完全一致［9］(1)。引物合成、测序工作均由赛百盛生物工程公司完成。 5.6B11mGM融合蛋白表达质粒的构建 　　为获得融合蛋白的高表达，我们选择了原核高表达质粒载体pET30a(+)。首先将6B11ScFv-hGM-CSF以合适的酶切位点自pL／6B11ScFv-hGM-CSF中完整切下，克隆到pET30a(+)之中，构建成pET30／6B11ScFv-hGM-CSF(2)。之后将1.4中成功克隆到的mGM-CSF，自pGEM-T／mGM-CSF中切下，置换pET30／6B11ScFv-hGM-CSF中的hGM-CSF，从而构建成功6B11GM融合蛋白的高表达载体pET30／6B11ScFv-mGM-CSF(3)。连接产物转化DH5α受体菌，内切酶酶切鉴定阳性克隆。将筛选出的pET30／6B11ScFv-mGM-SCF阳性克隆，转化BL21(DE3)受体菌，进行诱导表达。 6.6B11mGM融合蛋白的表达及包涵体处理 　　将含有pET30／6B11ScFv-mGM-SCF的BL21(DE3)受体菌经37℃培养，以0.4mmol*L-1IPTG诱导表达4h，收获菌体。超声破碎细菌，释放包涵体。10 000r*min-1离心20min，弃上清。将沉淀物用3mol*L-1尿素，含0.2g*L-1TritonX-100反复洗涤处理，得到纯化的包涵体，称重。           1　mGM-CSF的PCR克隆 Fig.The cloning of mGM-CSF by PCR                2　pET30／6B11ScFv-hGM-SCF 构建策略示意 Fig.2 The construction strategy of pET30／ 6B11ScFv-hGM-SCF                3　pET30／6B11ScFv-mGM-CSF 构建策略示意 Fig.3 The con