原发性肝癌组织库及数据库的建立.doc

原发性肝癌组织库及数据库的建立 目的：建立原发性肝癌组织库及数据库，通过对肝癌患者的血液、新鲜组织、病理蜡块等标本的收集、保存和研究，对其进行科学的管理和质量控制，为肝癌的基础和临床研究提供宝贵材料，并能为肿瘤患者的个性化治疗和随访提供帮助。 材料：肿瘤患者血液样本及肿瘤标本。 纳入标准：诊断为原发性肝癌或原发性肝癌转移的患者。患者对血液、样本采集均知情同意，符合医学伦理学标准。 排除标准：其他肿瘤转移到肝脏上的患者予以排除。 所需试剂及仪器： 1. 液氮罐 2. -80 ℃超低温冰箱 3. 4~-20 ℃冰箱 4. 离心机 我科均已配置 采集前准备：术前一天安排采集标本人员，填写肝癌标本临床资料表（对具有诊断意义的影像学资料进行照相留影存档），请患者或家属签署知情同意书，确认转移式液氮罐充满液氮，消毒灭菌两套手术标本采集器械（手术刀、手术剪、手术镊、不锈钢标尺、锡箔纸、冻存管）。手术当天携带冰盒、转移式液氮罐、标本采集器械、10%福尔马林溶液、照相机、标记好的冻存管（标本库专用标记码）、肝癌标本资料表等，提前入手术室准备好标本采集台，铺无菌手术巾，做好标本采集的准备。 1. 血清和血浆的采集及处理： 患者按术前、术中、术后当天、术后1 周等不同时间段取血，每次采6 mL 1 份3 mL EDTA抗凝，采血后轻轻颠倒混匀3次静置，防止溶血 1份3 mL不抗凝，室温静置 2 h，2 000 r/min离心10 min 抗凝2 h内分离血浆：2 000 r/min离心10 min。每管100 μL分装 3 mL N.S+3 mL抗凝静脉血，再加等体积Ficoll分离液至液面上，2 000 r/min离心10 min 加样器吸取血清，每管100 μL 分装，作蛋白组学分析 在界面白膜处吸取淋巴细胞，N.S漂洗3次，沉淀于冻存管 上述标本编号、作好标记，在采血后3 h内冻存在-80 ℃冰箱中 2. 组织标本的处理和保存： 手术结束后在不影响病理诊断取材需要的前提下采集组织样本。 整个切取标本的过程应控制在20分钟内。 用于提取RNA及蛋白的组织 新鲜组织的采集及保存 组织标本切成厚度小于0.5 cm小块，放入灭菌的EP管中，迅速放入冰盒 生理盐水冲洗2次，取肿瘤组织、癌旁组织(癌组织旁1 cm)、正常组织(癌组织旁3~5 cm以外或最远处)。将标本切成小块(0.5 cm×0.5 cm，厚度< 0.5 cm)，用锡箔纸包好减少组织脱水，放入冻存管中（每管中放置2-3块），标记后放入液氮保存。 冰盒EP管中的组织块利用RNAFast200和RIPA裂解液分别提取总RNA和蛋白。 石蜡固定标本的采集 10%福尔马林固定，24小时后制石蜡标本块，存放于4℃冰箱。 切片、染色。每例患者均保存2张H-E染色切片，明确病理诊断。 标本的RNA行1%琼脂糖凝胶电泳。 若A260/A280>1.6，28S和18S条带清晰明亮，且28S亮度强于18S，比值在2左右，则完整性良好。 若比值<1，则RNA已降解。 总蛋白测定浓度后加入5xloading Buffer并在100℃煮5min变性后放入-20℃冰箱中保存。 总RNA样本利用Fermentas反转录试剂盒逆转录成cDNA入-20℃冰箱保存 剩余RNA样本-80℃低温冰箱保存。 3. 标本的标记和储存 3.1 标本分装入冻存管。标记：冻存管编号、患者姓名、住院号、疾病种类、组织部位(或血清、血浆)、标本收集日期、标本入库日期。 3.2 冻存管编号由存放位置坐标确定。 3.3 数据库的管理。采用EXCEL软件。 3.3.1 患者信息录入：包括患者的姓名、性别、年龄、民族、职业、联系方式、随访时间、住院号（如多次住院则详细记录每次住院号）、临床诊断、病史摘要（主要记录有无肝炎、阳性家族史、黄疸、腹水、肝功Child分级等肝癌相关情况）、手术情况（包括手术方式、日期、术中探查所得重要信息、术中出血量等）、病理诊断（病理号）。患者辅助检查信息：检查项目、检查日期、检查结果等。 3.3.2 标本信息录入： （A）病理信息：肿瘤体积、组织类型、分级、浸润深度、切缘情况、门脉及肝门淋巴结情况。 （B）标本基本信息：入库编号、入库时间、入库类别、病变部位、标本描述（附照片）、标本采集时组织离体时间、收集人、保存方式、初步处理方式。 （C）存放位置信息：存放位置坐标。 3.3.3 标本使用管理：包括使用登记、标本原始位置、使用单位、使用人、经手人等。 3.3.4 标本废除管理：包括废除登记、标本原始位置、废除日期、废除原因、审批人等。 标本库的系统管理：标本的采集、保存、使用实行专人管理。管理人员经过专业的培训后，应严格按照标本库制定的各项规章制度进行标准化管理。定期核对，随机取库存标本进行光镜检查、核酸抽提，了解保存质量。病历资料严格按照规范化录入，定期进行统计学的分析。 注意事项： 1. 组织标本的离体时间对于标本的保存质量至关重要，应在切除后1 h内取材。 2. 应尽量避免基因组DNA、RNA和蛋白的降解。特别注意在取材、冻存和复苏过程中，尽量避免RNA酶的污染以及温度变化引起的细胞损伤破裂释放内源性RNA酶。 3. 应不定期的抽查标本长期保存后RNA的完整情况。