卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻方法.doc

卵母细胞和胚胎玻璃化解冻方法 用途： 本品用于卵母细胞和胚胎的玻璃化解冻配套。 安全解冻配套： 1. 1瓶4ml解冻液（TS） 2. 1瓶1.5ml稀释液(DS) 3. 1瓶1.5ml 冲洗液(WS) 4. 1个25mm 的培养皿(用于解冻液) 5. 1个6孔生殖板 使用说明 准备： *用载体和生殖板将解冻液放到37℃的培养箱里加温—将所有解冻液倒入生殖板里。 *用微细管吸取DS,WS1和WS2各300ul，放进培养皿。 注意：用巴斯德管吸取一个大小合适的卵母细胞（直径：140um）或者胚胎(直径：140-180um) 解冻： 1. 迅速地将载体顶放进解冻液中，浸泡1分钟。（图一） 2. 用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入DS底部，浸泡3分钟。（图二） 3. 用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS1 底部，浸泡5分钟。（图三） 4. 用巴斯德管吸起卵母细胞（胚胎），轻轻地将其放入WS2 顶部，当卵母细胞（胚胎）自动沉到底部的时候，重新再重复这一步骤。（图四） 5. 将卵母细胞（胚胎）转移到装有合适培养液的培养皿中。放进37℃的培养箱中完成恢复。注意：卵母细胞要放置2小时，胚胎则要3小时。 质量控制测试： 每一批安全解冻配套都得到以下测试： *溶液：UPS不孕不育无菌测试（SAL 10-3） LAL拉尔内毒素测试 小老鼠胚胎试验（一个细胞） 保存方法： *保存于4-8℃ *在标签所示有效日期前，本品性质稳定。 成分： *血清替代补充 *基本培养基M-199 内含的HEPES *蔗糖 参考文件（此部分请看原件）. 玻璃化 第一部分：所需材料 *玻璃化配套 No.0 基础液（BS）：1.5ml x1 (只用于卵母细胞玻璃化冷冻) No.1 稀释液（ES）: 1.5ml x1 No.2 玻璃化溶液（VS）: 1.5ml x2 *冷冻管x4, 建议每个冷冻管最多储存3个卵母细胞或者3个胚胎 *复制板x2: 6孔 *冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB) *巴斯德管（型号：MT-150） *显微镜（关掉加热板） *秒表或计算器（带计算功能） *液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤） *镊子 *显微针x2: 2-20ul, 100-1000 ul *罐子 *储存罐 注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。（卵母细胞内直径：140um，胚胎内直径：140-200um），尽量减少与玻璃解冻液的接触以提高解冻后的成活率。 平衡这个步骤，卵母细胞与胚胎步骤不一样。 第二部分 玻璃化准备 1. 将BS、ES和VS放到室温25℃--27℃。 2. 在管上写上客户信息 3. 冷却架要添加液氮至90% 4. 将装有卵母细胞或者胚胎的培养皿从培养箱中取出，用巴斯德管取出卵母细胞或者胚胎在显微镜下观察卵母细胞或胚胎的质量状况。 比较卵黄周隙与透明带的宽度，并做记录,这样更容易知道在ES浸泡后完成平衡液步骤。 卵黄周隙 透明带 注意：如果用的是卵母细胞则要将积云细胞出去。 第三部分 平衡 卵母细胞—平衡1 在复制板边上分别写上BS, VS1和VS2.用巴斯德管取出20ul的BS，300ul VS1和300ul VS2,放进复制板里（看下图）。 卵母细胞—平衡2 用巴斯德管取出卵母细胞，将其转移到BS（20ul）溶液底部。 卵母细胞—平衡3 (3分钟) 调整秒表（有计算功能），为以下步骤检查并设定好秒表。沿着复制板孔的边缘移动巴斯德管，轻轻地将20ul ES增加到有卵母细胞BS溶液的顶部，放置3分钟。 卵母细胞—平衡4 (3分钟) 仿照上个步骤再增加20ul ES溶液到顶部，放置3分钟。 卵母细胞—平衡5 (9分钟) 仿照上个步骤再增加240ul ES溶液到顶部，放置9分钟。在平衡液这个部分，卵母细胞大小要完全恢复，在卵母细胞在ES浸泡前，卵黄周隙宽度平均的时候，这个部分就完成了。 玻璃化配套 胚胎平衡 胚胎--平衡1 在复制板边上分别写上ES, VS1和VS2.将 将ES和两瓶VS充分混合。用巴斯德管分别取出300ul 溶液，立刻放进复制板里（看右图）。 胚胎--平衡2 用巴斯德管吸取胚胎于巴斯德管顶部，看右图。然后将胚胎放到ES中顶部。 胚胎--平衡3 （12到15分钟） 调整秒表（有计算功能），为以下步骤检查并设定好秒表。胚胎于30秒内自由脱落，它会自发地开始收缩，在ES渗透后，胚胎就会逐渐恢复到原来的大小，此时平衡步骤就完成了。 注意：胚泡平衡要等待卵黄周隙消失。胚泡玻璃化解冻最好的时候是胚胎直径达到140-180ul的时候。胚胎平衡的时间取决于胚胎的大小和质量，好的胚胎和小的胚胎所需时间就比较少。举例来说，一个好的胚胎8分钟完全恢复，平衡步骤已经完成。如果不能确定胚胎是否完全恢复，则停止平衡，12分钟进行原核细胞分裂， 15分钟进入桑椹胚和囊胚阶段，这样就足够了。 第四部分 玻璃化 这个部分对于卵母细胞和胚胎都是一样的，以下1到7步骤应在60-90秒内完成。 玻璃化 1 从ES溶液中用巴斯德管顶吸出卵母细胞（胚胎），看右图。然后将胚胎（胚胎）放到VS1中顶部,尽量减少携带ES溶液。仅将卵母细胞（胚胎）带进VS1，为了避免将ES带进VS1，首先将ES吹到孔的外边，将新鲜的VS1吹到孔的外面，用VS1吸入巴斯德管内。 玻璃化2—1分钟内 用巴斯德管吸入卵母细胞（胚胎）并放入VS1，在卵母细胞（胚胎）周围快速地搅拌5次。重新吸入卵母细胞（胚胎），在另外的位置放下VS1，在其周围快速地搅拌3次。改变卵母细胞（胚胎）周围的VS1溶液，直到ES溶液视觉上消失了。 玻璃化3—0.5分钟 将巴斯德管内的VS1溶液吹到孔外，将VS2溶液吸入巴斯德管，然后从VS1溶液中将卵母细胞（胚胎）吸入巴斯德管。将其放入VS2中，尽量减少带入VS1。在卵母细胞（胚胎）周围快速地搅动，变换2次位置，请看上图。当卵母细胞（胚胎）周围全被VS溶液包围并能观察到卵母细胞（胚胎）表面因脱水而萎缩时，此步骤即完成。 玻璃化4 将载体放在显微镜下观察（标签要朝上），调整将重点放在载体黑色标志上面。看下图。 玻璃化4 将载体放在显微镜下观察（标签要朝上），调整将重点放在载体黑色标志上面。看下图。 玻璃化5 用巴斯德管从VS2吸取收缩了的卵母细胞（胚胎），将卵母细胞（胚胎）放在载体的黑体位置，尽量减少带入VS2(少于1ul), 如果超过2个卵母细胞（胚胎），每个卵母细胞（胚胎）要1滴。看右图。 在载体上除去VS 将卵母细胞放在载体后，用吸液管将多余的VS液体吸去。 将吸液管顶部放在VS液底部 将吸液管横向拉开液体，使VS液体降低 吸取多余的VS液，尽量减少VS留下，但不能吸去卵母细胞（胚胎） 好样板 不好的样板 在载体黑色部分有1滴平面VS液体， 在载体黑色旁边有立体的VS液滴，VS2太多 玻璃化6 在显微镜下观察载体上的卵母细胞（胚胎）是否会有太多的VS液体，快速地将载体放入液氮中。 玻璃化7 用镊子夹住管帽，将载体尾端插入液氮中，然后用帽盖将载体拧紧。 用镊子夹住管帽，将载体插入 用手拿着管帽，套好 拧紧管帽，确定管帽扣紧载体 玻璃化8 检查管帽是否拧紧，将载体放入罐子里然后放入储存罐 注意：载体纸要一直放在液氮中，直到将其放入储存罐中，当有需要将载体转移到其他储存罐时，其中的时间要将载体放在液氮中，在解冻之前不能将载体暴露在空气中。 解冻 *第一部分 需要材料 玻璃化解冻配套 No.1 解冻液（TS）:1x4ml No.2 稀释液（DS）:1x1.5ml No.3 冲洗液（WS）:1x1.5ml No.4 培养皿：TS用35mm No.5 复制板：6孔 *冷却架(蓝盒液氮，型号：VT-CLB) *巴斯德管（型号：MT-150） *显微镜（关掉加热板） *秒表或计算器（带计算功能） *液氮（消毒过滤功能，聚四氟乙烯滤膜过滤） *镊子 *显微针: 100-1000 ul *罐子 *储存罐 注意：使用的巴斯德管大小要与卵母细胞或胚胎大小合适。（卵母细胞内直径：140um，胚胎内直径：140-200um），尽量减少与玻璃解冻液的接触以提高解冻后的成活率。 第二部分 解冻准备 1. 用培养皿装TS（密封）放进培养箱37℃回暖（大于1.5小时） 2. 将DS,WS置于室温内（25℃--27℃） 3. 取回装有载体的罐子，快速地将罐子插入装满液氮的冷却架中。取回冷却架的罐子，检查载体上标注的病人信息。 注意：用体视显微镜放置好冷却架 3. 在复制板边上分别写上DS, WS1和WS2. 将1瓶DS和两瓶WS充分混合。用巴斯德管分别取出300ul 溶液，立刻放进复制板里（看右图）。将复制板放在显微镜下观察。从培养箱取出TS溶液和培养皿，反转TS两次，使溶液均匀后将全部倒入培养皿中。 4.将显微镜重点对准装有TS的培养皿，用巴斯德管确定显微镜对准培养皿正中间。 . 解冻 第三部分 解冻 解冻1 轻轻地拧开和除去在液氮中的载体管帽，竖立在冷却架的边角。 解冻2 准备好用巴斯德管将载体固定在液氮中，设置好秒表（有计算功能）。为以下步骤检查并设定好秒表。 解冻3 快速地将载体放入在显微镜下的TS，时间应为1秒钟（看左下图）。卵母细胞（胚胎）要在载体黑色部分中间。泡在TS 1分钟，卵母细胞（胚胎）与载体纸分离后，轻轻地用巴斯德管吸取卵母细胞（胚胎），就算卵母细胞（胚胎）没与载体分离也要将其吸入巴斯德管。同样，吸取TS液，知道卵母细胞（胚胎）达到巴斯德管顶2mm. 第四部分 稀释 稀释—3分钟 慢慢地从巴斯德管将TS液放入DS液 底部，然后慢慢地将卵母细胞（胚胎）放到DS液 的TS底层。放置3分钟，这个步骤是将卵母细胞（胚胎）从TS逐渐转移到DS液中。 第五部分 冲洗 冲洗1—需时5分钟 浸泡在DS液中3分钟后，用巴斯德管从DS液中轻轻地吸取卵母细胞（胚胎），同时，吸入DS液，直到卵母细胞（胚胎）离巴斯德管顶2mm。 首先只将巴斯德管里的DS液放入在WS1 底部，然后轻轻地将卵母细胞（胚胎）放入到WS1底部的DS层里。这个步骤主要是将卵母细胞（胚胎）逐渐从DS液转移到WS中。 冲洗2—需时1分钟 浸泡在WS1液中5分钟后，用巴斯德管从WS1液中轻轻地吸取卵母细胞（胚胎），要尽量减少WS1的吸入，然后将卵母细胞（胚胎）转移到WS2顶部。当卵母细胞（胚胎）自由落到WS2底部时，重新再做一次以上步骤。看下图所示： 冲洗3 将卵母细胞（胚胎）放入含有适当培养液的培养皿中，将卵母细胞（胚胎）放进37℃培养箱中完成恢复。 完成恢复全过程所需时间为：卵母细胞-2小时，胚胎-3小时。