2023年肝糖原的提取.鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定.docx

肝糖原的提取.鉴定与定量肝糖原的提取与鉴定 生物化学实验报告 姓名： 学号：31300202320231 专业年级：2023级临床医学 组别：第2实验室 生物化学与分子生物学实验教学中心 实验名称肝糖原的提取、鉴定、别离实验日期2023-12-25合作者评分 陈海玲 教师签名 实验地点 第2实验室 指导老师朱利娜 批改日期 一、实验目的 1、掌握组织样品的制备方法，了解其本卷须知。 2、了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和本卷须知，掌握其操作方法。 3、正确操作使用刻度吸管和可调微量取液器。 4、熟练运用溶液混匀的各种方法。 5、正确掌握溶液转移的操作。 6、正确操作使用分光光度计。 二、实验原理 ●肝糖原的提取 糖原储存于细胞内，采用淹没匀浆等方法可使细胞破碎，低浓度的三氯醋酸能使蛋白质变性，破坏肝组织中的酶且沉淀蛋白质，而糖原仍稳定地保存于上清液中，从而使糖原与蛋白质等其他成分别离开来。糖原不溶于乙醇而溶于热水，故先用95%乙醇将绿叶中糖原沉淀，再溶于热水中。●糖原的鉴定 糖原水溶液呈乳样光泽，遇碘呈红棕色。这是糖原中葡萄糖长链形成的螺旋中，依靠分子间引力吸附碘分子后呈现的颜色。糖原还可被酸水解为葡萄糖，利用呈色反响和葡萄糖的复原性，可判定肝组织中糖原的的存在。cuso4+2naoh=na2so4+cu（oh）2cu（oh）2+c6h12o6=2cuoh+氧化型葡萄糖+h2o 2cuoh=h20+cu2红色）cu（oh）2====h2黑色）●肝糖原的定量 糖原在浓酸中可水解为葡萄糖，浓硫酸能使葡萄糖进一步脱水生成糠醛衍生物——5-羟甲基呋喃甲醛，此化合物再与蒽酮脱水缩合生成蓝色的化合物。该物质在620nm处有最大吸收。糖含量在2023—20230mg范围内，溶液颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。利用此反响与同样处理的葡萄糖含量的标准溶液比色，通过标准对照法即可计算出样品中糖原的含量。糖原在浓碱溶液中非常稳定，故在显色之前，肝组织先置于浓碱中加热，以破坏其他成分，而保存肝糖原。 三、实验材料 ●仪器： 1、普通离心机，室温-20230℃恒温水浴箱（x2），722型分光光度计，精度为2023mg级电子天平2、剪刀、镊子、研钵3、试管架，离心管，试管 4、刻度吸量管（2ml，5ml），202300μl微量可调取液器5、20230ml容量瓶6、白瓷反响板●试剂： 鸡肝、95%乙醇、0.31mol/l（5%）三氯醋酸溶液、0.15mol/lnacl溶液、浓hcl、12.5mol/l（50%）naoh、碘试剂、班氏试剂、30%koh溶液、标准葡萄糖液（50mg/l）蒽酮显色剂 四、实验步骤 ●肝糖原的提取 鸡肝约1.5g，剪碎 +5%cclcooh1ml 3 研磨至乳状 +5%ccl3cooh3ml研磨成肝匀浆 全部转入离心管中，离心3min（4000r/min） 取上清液 +5ml95%乙醇，混匀，静置2023min离心5min（ 4000r/min） 取沉淀+蒸馏水2ml 沸水浴2min，溶解沉淀 +浓hcl0.2ml 15min，冷却 糖原溶液0.1ml 呈色比照 +班氏试剂0.2ml（4d） 混匀 沸水浴，观察变化●本卷须知： 1、提取肝糖原时，向上清液中参加等量的95%乙醇后，必须混匀。由于上清液为水溶液，比重大于95%乙醇，溶液分成两层。加之上清液已4ml多，加上等量 乙醇，总量接近9ml，混匀操作比较困难，最好用倾倒混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2、糖原中葡萄糖螺旋链吸附碘产生的颜色与葡萄糖残基数的多少有关。葡萄糖残基在20个以下的会使碘呈现红色，20-30个之间使碘呈现紫色，60个以上的会使碘呈现蓝色。淀粉中分支链较长，故呈蓝色，而肝糖原分枝中的葡萄糖残基在20个以下（通常8-12个葡萄糖残基），吸附碘后呈现红棕色。 3、糖原水解液中鉴定葡萄糖时，加班氏试剂不能过量，否那么反响液呈黑色浑浊，观察不到应有的结果。肝糖原定量测定 鸡肝0.15g +30%koh1.5ml沸水浴15min 冷却，全部转入20230ml容量瓶中 加水至标线，仔细混匀，获得糖原提取液 取3支干净的试管，按下表操作： 试剂（ml）空白管蒸馏水 标准葡萄糖溶液糖原提取液0.2%蒽酮溶液 1.0————2.5 标准管——1.0——2.5 样品管————1.02.5 混匀，沸水浴2023min，冷却。在722型或721型分光光度计620nm波长处，用空 白管溶液调零，测定各管溶液的吸光度（a）.计算： 肝糖原（g/20230g肝组织）= 20230a测定20230 x0.05xxx1.11a标准肝组织重（g）202300 五、实验现象与结果讨论 ●糖原水解液加班氏试剂沸水浴后无明显变化。 ●糖原溶液加碘试剂后呈红棕色，但与碘试剂原来颜色区别不大。 ●鸡肝加碱沸水浴后分层，上层为红棕色，下层无色。 ●参加蒽酮溶液并且水浴过后的空白管、标准管、样品管（由左至右）比照 ●将空白管在620nm处的a值设定为0，测得标准管、样品管的a值如下： 123平均值 空白管0000 标准管0.620230.6120.6160.613 样品管0.202350.202350.20232023.20237 肝糖原（g/20230g肝组织）= 20230a测定20230 x0.05xxx1.11a标准肝组织重（g）202300 ≈0.525 从肝糖原的定量试验中可知鸡肝样品中含有糖原，但在定性实验中结果不明显，可判断实验所采用的鸡肝样品含糖原量比较少，造成鸡肝糖原量少的原因可能是用于实验的鸡处于饥饿状态，糖原分解以维持血糖稳定，因此使肝中剩余的糖原量少于非饥饿状态下的鸡的肝糖原含量。 第7页 共7页