凝血酶的提取.doc

凝 血 酶 的 提 取 凝血酶是机体凝血系统中的天然成分，它由两条肽链组成，多肽链之间由二硫键连接。凝血酶在体内以凝血酶原形式存在，在一定条件下凝血酶被激活并转化为有活性的一种蛋白质水解酶。分子量335800，白色无定形粉末，溶于水，不溶于有机溶剂。 目前国内主要从动物血浆及人血浆中制备凝血酶，在经激活物激活而成为凝血酶。它可催化血纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，转变成不溶性血纤维蛋白凝块。凝血酶在临床上应用广泛，常以干粉或溶液局部涂于伤口及手术处，控制毛细血管血液渗出，多用于骨出血、扁桃腺摘除和拔牙时出血等。有时也可口服，用于胃和十二指肠出血。凝血酶局部止血效果好，且无副作用。目前凝血酶的应用范围正日渐扩大，由单纯的局部外敷发展到外科手术、耳鼻喉、口腔、妇产、泌尿及消化道等部位出血的止血，亦可作为多种外用止血药物的重要原料，其止血效果优于“对氨基苯甲酸”、“止血环酸”、“止血敏”等通过注射后须经血管收缩而起止血作用的药物，顾深受广大用户的欢迎，将广泛应用于临床。由于临床使用该药日渐广泛，将使目前十分紧俏的凝血酶更趋紧缺，因此生产前景看好，只要原料有保证，技术过关，就可获得产品。 （一）原料及试剂： 1、动物血液：须选用新鲜的动物血液，防止混入其它杂志。盛血液的器具一定要干净。 2、柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O）：又名枸橼酸钠。无色晶体或粒状粉末。相对密度1.875。150℃时失去结晶水，温度再高则分解。溶于水，难溶于乙醇。本工艺中主要作抗凝血剂用，防止血液凝固。选用化学纯试剂。 3、醋酸：学名乙酸。无色澄清液体，有刺激气味。相对密度1.049，沸点118℃。溶于水、乙醇和乙醚。用于调节pH值。选用化学纯试剂。 4、氯化钠：白色立方晶体或细小结晶粉末。相对密度2.165，熔点801℃。味咸，中性。有杂质时易潮解。溶于水和甘油，难溶于乙醇。选用一级工业品。 5、氯化钙：白色立方晶体，易潮解，相对密度2.15，熔点782℃，沸点大于1600℃，溶于水、乙醇。本工艺中用作激活剂，选用分析纯试剂。 6、丙酮：无色易挥发、易燃液体。有微香气味。相对密度0.7893，沸点56.5℃。于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿等混溶。能溶解油、脂肪、树脂和橡胶。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物，化学性质活泼。本工艺中用作沉淀剂，选用化学纯试剂。 7、乙醇：又称酒精，无色透明易挥发、易燃的液体。有酒味和刺激辛辣滋味。相对密度0.789。沸点78.4℃。溶于水、甲醇、乙醚、氯仿等。有吸湿性，能与水形成共沸混合物。其蒸汽与空气形成爆炸性混合物。本工艺中用来洗涤凝血酶，选用工业乙醇。 8、乙醚：又称二乙醚。是易流动的无色透明液体。有令人爽快的特殊气味，其蒸汽能使人失去知觉，甚至死亡。相对密度0.7135，沸点34.5℃。难溶于水，易溶于乙醇和氯仿等溶剂，极易挥发和着火。本工艺主要用于洗涤凝血酶，选用化学纯试剂。使用时，操作人员应注意防护，避免吸入，周围应杜绝明火并保持空气流通。 9、草酸钾：又名乙二酸钾。这里用于测定凝血酶活性，选用分析纯试剂。 10、标准纤维蛋白原：这里用于测定凝血酶效价，选购药检部门提供的标准品。 （二）凝血酶的提取工艺： 1、工艺流程： 2、操作步骤： （1）分离血浆，提取凝血酶原：取动物血液，按每千克动物血液加3.8克柠檬酸三钠投料，搅拌均匀，装入离心管中，以3000转/分的速度离心15分钟，分出血球（可供制备血红素），收集血浆。把血浆溶于10倍蒸馏水中，用1%浓度的醋酸调节pH值至5.3，在离心机上离心15分钟，弃去上清液，收集的沉淀物即为凝血酶原。 （2）凝血酶原的激活：在30℃的条件下，将凝血酶原溶于1~2倍的0.9%氯化钠溶液中，搅拌均匀，加入占凝血酶原重量1.5%的氯化钙，搅拌15分钟，在4℃下放置1.5小时左右，保证凝血酶原转化为凝血酶。 （3）沉淀分离凝血酶：将激活的凝血酶溶液用离心机离心15分钟，弃去沉淀。上清液移入搪瓷桶中，加入等量的预冷至4℃的丙酮，搅拌均匀，在冷处静置过夜，然后用离心机分离，收集沉淀，上清液可供回收丙酮。沉淀用丙酮洗涤并研细，在冷处静置3天左右，然后过滤，沉淀分别用乙醇和乙醚洗涤一次，放置在干燥器或石灰缸中干燥，即得凝血酶粗品。 （4）除杂、沉淀、干燥：把粗品溶于适量（1倍左右）的0.9%氯化钠溶液中，在0℃放置6小时以上，然后用滤纸过滤，滤出的沉淀再用0.9%氯化钠溶液溶解，在0℃放置6小时以上，过滤，合并两次滤液，用1%醋酸溶液调节pH值为5.5。然后离心，弃去沉淀，收集上层清液。在清液中加入2倍量预冷至4℃的丙酮，静置3小时，离心30分钟，收集沉淀。沉淀再浸泡于冷丙酮中，静置过夜，然后过滤，沉淀分别用无水乙醇、乙醚各洗涤一次，干燥即得产品。 （三）凝血酶效价测定： 1、标准纤维蛋白测定法：凝血酶的单位定义为活度量，即1毫升标准纤维蛋白原溶液在28℃、15秒钟内产生凝集的量为一个单位。具体做法是：将凝血酶样品配成适当浓度，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纤维蛋白原溶液，于28℃测定其凝结时间（先将凝血酶配成一定浓度），得到每毫克样品所含单位的估算值。在按估算值配成0.2毫升含1个单位的凝血酶溶液，取0.2毫升加入0.8毫升0.125%纤维蛋白原溶液中，凝结时间须为15秒。 2、草酸盐牛血清测定法：即1毫升草酸盐牛血清在28℃、15秒钟内产生凝集则含凝血酶2.25单位。具体做法是：7份牛血清与1份等渗草酸钾溶液（1.85%）混合，离心分离得草酸盐牛血清（-40℃只能保存两个星期）。取几只试管，各加0.9毫升草酸盐牛血清，依次加入不同稀释度的凝血酶样品溶液0.1毫升，通过反复试验，确定适宜的稀释度，使之在15秒钟内产生凝集。同前面的定义一样，在15秒钟出现凝集的试管含2.25单位凝血酶。估量稀释度后，很快就可以确定凝血酶原液的滴定度及每毫升或每毫克凝血酶的单位。 （四）工艺评价： 国外已有报道以牛血浆为原料制备凝血酶，也可用猪血浆为原料分离制备凝血酶，以达到充分利用我国丰富的猪血资源之目的。 猪血中，血浆与血球之体积比为55∶45，通常1000毫升全血用离心机分离只能得到500毫升血浆。新鲜猪血不能立即分离，需尽快冷至15℃以下（时间太长猪血会发生腐败），再进行分离。温度愈低，血浆、血球愈容易分离。用以上工艺，每1000毫升血浆可制得凝血酶粗品约10克，凝血酶精品约0.4克。即粗品收率约百分之一，精品收率约万分之四。 原有的凝血酶制备方法，获得的凝血酶效价最高约每毫克干重950单位，即每毫克氮约6600单位。沃尔特等报道，经过改进的凝血酶制备方法，其分离获得效价为每毫克氮约12000单位的凝血酶组分。并由溶解度曲线表明制剂含有两个明显不同溶解度的活性组分，它们的效价分别是每毫克氮10086单位及13365单位，从而推断凝血酶有两个活性组分，即存在两个天然凝血酶分子。 采用一般方法制备的凝血酶通常为灰白色粉末，将其溶于生理盐水中通常得到的是半透明胶状悬浊液。这是因为含有杂质的缘故。若制备过程中采取了透析及硫酸铵进行分级分离等步骤处理，凝血酶的纯度将大大提高。其精品色雪白，极易溶于水，水溶液呈清透明，医疗价值更高。因此根据需要，可制备凝血酶制剂和高纯度凝血酶无菌干冻品。 我国猪肉资源十分丰富，血浆原料充足（平均每头猪可回收血浆1升），血球可作为制备超氧化物歧化酶及血卟啉类等的原料，且凝血酶局部止血效果良好，具有医用价值。因此，由猪血制备凝血酶的前景是令人乐观的。 （五）市场分析： 据了解，目前国际上仅有英、美、日等少数发达国家能在低温状态下从人或牛血液中人工提取凝血酶，但因受其生产环境、血源等因素制约，其产量很小，远远满足不了市场需要，其产品主要用于生化制药产品的鉴定，很少直接用于临床，因其价格十分昂贵，很难被用户接受。当前我国主要从猪血中提取凝血酶，产品已应用于临床，但由于技术原因、原料分散等因素的制约，故产量也比较小，远远满足不了国内临床的需求。随着凝血酶应用的不断推广，用量迅速扩大。加之世界一些地区战乱，伤病人数增加，对高效局部止血药的需求更难以估计，产供矛盾也将更为突出，市场价值有增无减，国内外市场前景相当广阔。 凝血酶是以凝血酶原的形式存在于人或动物血液中，而我国人口众多，属于食肉大国，其动物血源均白白流失，成为污染环境的一大公害。提取凝血酶既可变废为宝，为国家创汇，而且还可解决环境污染问题，所以生产前景是乐观的。 （六）注意事项： （1）动物血液一定要新鲜，要防止血液凝固、溶血。 （2）所用器具一定要干净，以防影响产品的纯度。 （3）试剂配制及pH值调节一定要准确，方可保证产品产量及质量。 （4）生产温度应控制在规定的条件下，低温提取，方可保证酶不失活。 （七）生产设备及器具 离心机 1台 搅拌机 1台 布氏漏斗（9 毫米） 2个 搪瓷桶（20 升） 4只 温度计（0~100℃） 1支 干燥器 2个 天平（万分之一） 1台 pH试纸（1~14） 2本 烧杯（2000 毫升） 1只 （1000 毫升） 1只 （100 毫升） 2只 （50 毫升） 2只 量筒（1000 毫升） 1只 （300 毫升） 1只 （100 毫升） 1只