大肠杆菌的培养.doc

大肠杆菌种子液的制备 牛肉膏蛋白胨培养基的配方： 液体培养基 牛肉膏 3.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 5.0g 水 1000ml pH 7.4-7.6 固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 1 试管斜面与平板的制备 （1） 称量 按培养基配方比例依次准确称取蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、琼脂、水放入烧杯中。 （2） 熔化 在上述烧杯中先加入少于所需要量的水，用玻璃棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，药品完全溶解后，补充水到所需的总体积。将称量好的1.8％琼脂放入已溶的药品中，再加热熔化，最后补充所损失的水分。 （3） 调PH 在未调PH前，先用精密PH试纸测量培养基的原始PH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/L NaOH,边加边搅拌，并随时用PH试纸测基PH直到PH达到7.4-7.6。反之用1mol/L HCl进行调节。 （4） 分装 将培养基分装入三个试管中和三角烧瓶中。其试管装量不超过管高的1/5，三角烧瓶的量不超过1/2加塞 培养基分装完毕后，在试管口和三角烧瓶口上塞上棉塞。 （5） 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 （6） 灭菌 将上述培养基以0.1Mpa,121℃,15min高压蒸气灭菌。 （7） 倒平板 ，取三个已消毒的培养皿，在无菌操作台上用三角烧瓶中的培养基倒制三个平板培养基，冷却。 （8） 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁在玻璃棒上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。 2 接种大肠杆菌斜面种子 (1) 取实验室储备的大肠杆菌BL21种子， 在酒精灯附近，用接种环在已制备好的斜面上接种上大肠杆菌。 (2) 将接种好的斜面放入37℃的恒温培养箱子中培养24h。 3 制备平板种子 (1) 在无菌条件下，取一支保存的大肠杆菌的斜面，用无菌生理盐水将菌种冲洗下来，再用无菌生理盐水将其梯度稀释为1倍，10倍，100倍和1000倍，用移液枪分别吸取各梯度的溶液涂布平板(每个梯度涂布三个平板，每次吸取溶液100ul)，然后在37℃培养箱中过夜。 （12） 次日，挑取生长状态好，特征明显的单个菌落，接种于新鲜灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基中37℃，170r/min恒温振荡培养18h作种子培养液。 其后的实验中，每次实验前从种子培养液中吸取2ml菌液接种于新鲜灭菌的液体培养基中，37℃，170r/min恒温振荡培养 使用牛肉膏蛋白胨培养基 组成成分：牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,Nacl 5g,琼脂 15～20g,水1000mL,PH7.4～7.6。 具体配置步骤： 1.称药品 按实际用量计算后,按配方称取各种药品放入大烧杯中.牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量,用热水溶解后倒入大烧杯;也可放在称量纸上称量,随后放入热水中,牛肉膏使与称量纸分离,立即取出纸片.蛋白胨极易吸潮,故称量时要迅速. 2.加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量,然后放在石棉网上,小火加热,并用玻棒搅拌,待药品完全溶解后再补充水分至所需量.若配制固体培养基,则将称好的琼脂放入己溶解的药品中,再加热融化,此过程中,需不断搅拌,以防琼脂糊底或溢出,最后补足所失的水分. 3. 调pH 检测培养基的pH,若pH偏酸,可滴加lmol/L NaOH,边加边搅拌,并随时用pH试纸检测,直至达到所需pH范围.若偏碱,则用lmol/L HCl进行调节.pH的调节通常放在加琼脂之前.应注意pH值不要调过头,以免回调而影响培养基内各离子的浓度. 4.过滤 液体培养基可用滤纸过滤,固体培养基可用4层纱布趁热过滤,以利培养的观察.但是供一般使用的培养基,这步可省略. 5.分装 按实验要求,可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内.分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染. 分装量:固体培养基约为试管高度的l/5,灭菌后制成斜面.分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜.半固体培养基以试管高度的1/3为宜,灭菌后垂直待凝. 6.加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞.棉塞的形状,大小和松紧度要合适,四周紧贴管壁,不留缝隙,才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用.要使棉塞总长约3/5塞入试管口或瓶口内,以防棉塞脱落.有些微生物需要更好的通气,则可用8层纱布制成通气塞.有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞. 7.包扎 加塞后,将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸,以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞.若培养基分装于试管中,则应以5支或7支在一起,再于棉塞外包一层牛皮纸,用绳扎好.然后用记号笔注明,培养基名称,组别,日期. 8.灭菌 将上述培养基于121.3℃湿热灭菌20min.如因特殊情况不能及时灭菌,则应故入冰箱内暂存. 9.无菌检查 将灭菌的培养基放入37℃温箱中培养24～48h,无菌生长即可使用,或贮存于冰箱或清洁的橱内,备用. 大肠杆菌的培养： 37摄氏度，恒温培养48到72小时，因为接种时和具体培养条件的不同，其生长一般都在2天外才能长出明显的菌落。 菌落特征：乳白色，圆形，菌落边缘整齐，表面光滑，表面和背面颜色一致。 大肠杆菌 / 大肠菌群显色培养基是青岛海博生物公司改良的培养基，用于食品、水、牛奶、冰激凌和肉制品中大肠杆菌和大肠菌群的快速检测。大肠杆菌显蓝色至紫色，大肠菌群显红色。 成份 (g/L) 特殊营养物质 28.19 混合显色剂 0.31 琼脂 13.0 pH 6.8 ± 0.2 25 ℃ 此配方可以进行改良或增加营养成份以获得最佳的结果。 注意 此培养基仅供实验室使用。 用法 称取本品 41.5g 加入 1000ml 蒸馏水，加热溶解并不停搅拌，煮沸不要超过 1 分钟。取 1ml 制备好的样品液加入直径为 9cm 无菌平皿中心，倾入冷却至 45-50 ℃培养基约 15ml ，混匀，凝固后，再加入一层培养基进行履盖。或冷却至 45-50 ℃时，倾入无菌平皿，琼脂完全凝固后，在 37 ℃的培养箱中倒置放置 1-2 小时，加入适当稀释度的样品液 1ml ，涂布于培养基上， 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h 。 贮存 制备好的平板应立即使用，应避免光线直接照射。干燥培养基应放置于阴暗干燥处， 保存温度 2-8 ℃，注意避光保存。 失效 干燥培养基超过保质期、结块和颜色变化都不能使用。 操作步骤 1 、按国家标准、 SN 标准、 FDA 标准或其它方法制备样品液 2 、取样品液 1ml 加入 冷却至 45-50 ℃显色培养基中混匀或 涂布于平板上 3 、 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h ，选用有 30 ～ 200 个菌落的平板，计数平板上出现的典型大肠菌群和大肠杆菌菌落。大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色或黄色菌落。 总大肠菌群 = 蓝色菌落 + 紫色菌落 + 粉红色菌落 大肠杆菌 = 蓝色菌落 + 紫色菌落 4 、对可疑大肠杆菌菌落可划线接种到营养琼脂平板上， 36 ± 1 ℃培养 12-16 小时，挑取单菌落做大肠杆菌全套生化试验 ( 本公司有生化鉴定管套装 20 支 x3 种 ) 质量控制 1 、外观 此干燥培养基的粉末均匀，具有良好的流动性，呈淡红色。制备好的平板呈透明粉红色固体培养基。 2 、微生物试验 在 36 ± 1 ℃培养 18 ～ 24h 小时： 质控菌株 ATCC 生长情况 菌落颜色 单增李氏菌 27853 -/+ 无色 金黄色葡萄球菌 25923 -/+ 无色 大肠杆菌 25922 +++ 蓝色 沙门氏菌 +++ 无色 大肠菌群 +++ 粉红色 方法的局限性 本培养基鉴定 大肠菌群 / 大肠杆菌，少数情况下可能会出现假阳性，但不会出现假阴性，有时可能需做其它补充试验。 典型特征 大肠杆菌典型菌落为蓝色至紫色，大肠菌群为粉红色菌落，其它细菌为无色菌落。