实用血培养厌氧菌分离鉴定及药敏试验方.doc

实用厌氧菌分离鉴定及药敏试验方法 临床重要的厌氧菌(主要是内源性)主要是拟杆菌科（G-b）和厌氧球菌。血培养阳性厌氧菌主要有拟杆菌属、梭杆菌属、、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、消化链球菌属及其他厌氧菌。 一、必需的设备 • 厌氧罐、厌氧盒、厌氧袋（标本少） • 厌氧发生气袋 • 厌氧指示剂 二、培养基的准备 • 非选择厌氧血平板 布氏血平板 脑心浸液琼脂 CDC厌氧血琼脂 哥伦比亚血琼脂 新鲜配制或经24h预还原（厌氧环境放置）！！！ 特殊成份（降低氧还电势）: L-半胱氨酸、氯化血红素(Hemin)、VitK1 · 选择性厌氧血平板：自制、商商品化 三、 厌氧血培养瓶报警后 步骤一：转种 转种（四区划线） 需氧 厌氧 血平板、巧克力平板，5％CO2 还原后的厌氧血平板 24h检查 生长，G染色，分离，鉴定 —— 48h 检查 原始平板是否有新菌落出现 打开 步骤二：耐氧试验确认厌氧菌 培养48h后可能有以下几种情况 需氧 厌氧 血平板 巧克力平板 处理方法 厌氧血平板 处理方法 情况一 + + 常规 + 耐氧试验、G染色 再培养48h 情况二 — + 可能流感杆菌 + 情况三 — — + G染色，厌氧菌 情况一和二：耐氧试验24-48h再观察结果，有确认厌氧菌的菌落按下边鉴定步骤。 耐氧试验方法：选择每种形态的单菌落，转种一个厌氧血平皿和巧克力平皿，分别培养。 情况三：相当于耐氧试验，再结合菌落菌体形态，可以确认厌氧菌，用以下方法鉴定。 四、厌氧菌鉴定方法 （一）快速商品鉴定系统（4h报告结果） 1 无须厌氧培养，4h培养后人工输入结果，电脑软件辅助报告结果： VITEK ANI卡 Rap ID 32A MicroScan Anareobe Panel Rap ID ANA II等 2 厌氧环境培养24-48h观察结果 API 20A 特点是快速，可鉴定到种水平，但有时不一定获得满意结果，可同时进行以下操作提供临床初步报告。 （二）初步鉴定方法 1 临床重要的厌氧菌特殊菌落形态和菌体形态及特征（图示） · G-cb有色素——普雷沃菌、卟啉单胞菌 · 细G-b，两端变尖——具核梭菌 · 多晶（空泡），染色着色浅G-b——拟杆菌属 · 非常小的G-c——韦容球菌属 · “咬”琼脂（凹陷）—— 解尿拟杆菌群 2 产色素、荧光 · 产黑色素拟杆菌——卟啉单胞菌、普雷沃菌 · 砖红色荧光——中间普雷沃菌、洛氏普雷沃菌 · 黄绿色荧光——梭杆菌属 3 特殊鉴定用抗生素纸片（Oxoid, BBL,Diffico等） 万古霉素5μg/ml 卡那霉素1,00μg/ml 多粘菌素10μg/ml 聚茴香脑磺酸钠(SPS)1,00μg/ml：抑菌环直径小于10mm（R），大于12mm（S） 于厌氧血平皿贴1/4平皿（划线第一区）；如果需要硝酸盐或SPS纸片，则贴另1/4区 菌群 万古 卡那 多粘菌素 SPS G- R V V G+ S V V B.frag 群 R R R 解尿拟杆菌群 R S S 梭杆菌属 R S S 卟啉单胞菌属 S R R 普雷沃菌属 R R V 韦荣氏球菌属 R S S 厌氧消化链球菌 S Rs R S 其他G+c S S R R 4 生化反应 触酶、吲哚、硝酸盐 五、厌氧菌药敏 1 经验用药 J >99%厌氧菌对甲硝唑、克林霉素、氯霉素、亚胺培南敏感 J 95—99%β- 内酰胺酶/β- 内酰胺酶抑制剂 复合抗生素类、 K 革兰阴性厌氧杆菌对头孢菌素类抗生素敏感性不同，头孢菌素类、β- 内酰胺酶、青霉素类等。 2 常规做厌氧菌药敏试验指征 · 脑脓肿、心内膜炎、骨髓炎、关节感染、血管移植、辅助装置、菌血症从正常无菌部位来源的标本，除非确认是污染的。 J 医生是否要求做药敏试验是非常重要的 L 当几种菌混合感染确定哪个菌做药敏，做什么抗生素很难判断，一般来讲，具有高致病性的菌或不能预测药敏结果的常用抗生素，或两者具备，考虑做药敏试验，包括拟杆菌属某些种，普雷沃菌属、梭杆菌属，梭菌，Bilophila, and Sutterella. L 不能用临床标本直接做药敏 3常规厌氧菌药敏方法 1） β- 内酰胺酶 除脆弱拟杆菌外的菌在做药敏试验前都应检测β－内酰胺酶试验。决大多数脆弱拟杆菌都产β－内酰胺酶，应报告青霉素、阿莫西林和氨苄西林耐药。 2 ）E-test方法 重症，血培养来源的厌氧菌适用。 E-test方法是琼脂稀释法的替代方法，注意判读结果时尽量保守，否则容易出现“非常主要错误”。E-test方法是精确和实用的药敏试验方法。 3）其他适合临床使用的商品药敏系统 Dubreuil等评价ATB ANA(Version 96)系统（生物梅里埃）与琼脂稀释法对200株临床分离厌氧菌对9种抗生素的结果后指出，ATB ANA是临床做厌氧菌药敏试验非常方便的方法， 结果与参考方法较符合。此系统可按照法国临床微生物学会抗生素分会和NCCLS两种标准解释结果。 六、报告结果 初级报告 最终报告