外成骨诱导培养与成骨细胞活性鉴定.doc

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究 张开刚1 张月东1 王玫2 （1.泰安市中心医院骨科，山东泰安271000 2.泰山医学院，山东泰安 271016） 【摘要】目的 体外分离培养兔脂肪干细胞，在成骨诱导条件下，鉴定其成骨活性。方法 取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞, 将第3代ADSCs消化后，加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Von Kossa（钙结节）染色鉴定分化结果.结果 体外分离培养的细胞增殖活跃，成骨诱导后检测碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Von Kossa（钙结节）染色均呈阳性表达。结论 脂肪干细胞具有成骨分化能力, 是一种理想的骨组织工程种子细胞。 【关键词】脂肪干细胞；成骨诱导；种子细胞 An experimental study of osteogenic culture in vitro and identificating the osteogenic activity of rabbit adipose-derived stem cells ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2 （1.Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016） 【Abstract】Objective Separating and Culturing rabbit adipose-derived stem cells， identificating the osteogenic activity in osteogenic conditions.Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits aged 4 months, Using I collagenase digestiong, separating, culturing and passaging of the original cells, adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation after digesting the 3rd generation ADSCs, then identificating the differentiation results by alkaline phosphatase staining、alizarin red staining、Von Kossa (calcium nodules) staining.Results The cells of Separating and Culturing in vitro were active, the alkaline phosphatase staining、alizarin red staining and Von Kossa (calcium nodules) staining were both positive expression after osteogenic.Conclusion Adipose derived stem cells have the ability of Osteogenic differentiation,they are an ideal seed cells for bone tissue engineering. 【Keywords】Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed Cells An Experimental study of Adipose stem cells cultured in vitro osteogenic and osteogenic activity identification ZHANG Kaigang1, ZHANG Yuedong1, Wang Mei2 （1.Department of Orthopedic Surgery,Taian Center Hospital,Shandong Taian, 271000 2. Taishan Medical College，Shandong Taian 271016） 【Abstract】Objective Isolation and Culture of adipose stem cells in osteogenic conditions to identify osteogenic activity. Methods Extracting inguinal fat of New Zealand white rabbits aged 4 months, Using I collagenase digestion, separation, culture and passage of the original cells, the 3rd generation ADSCs after digestion, by adding osteogenic medium to induce osteogenic differentiation, alkaline phosphatase staining were performed, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nodules) staining differentiation results. Results Proliferation of isolated and cultured cells cultured in vitro Active is active, Detection of bone alkaline phosphatase staining after induction, alizarin red staining, Von Kossa (calcium nodules) were both positive for expression. Conclusion Adipose derived stem cells have the ability to differentiate into bone, it is an ideal seed cells for bone tissue engineering. 【Keywords】 Adipose-Derived Stem Cells; Osteogenic; Seed Cells 脂肪干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是近年来发现的一种成体干细胞，2001年，Zuk〔1〕等首次从人的脂肪组织悬液中分离出了具有与骨髓间充质干细胞类似，可以在体外稳定增殖、具有多向分化潜能的脂肪干细胞。因具有来源丰富、取材方便、对机体的损伤小、增殖快、能多向分化等优点,迅速成为组织工程学、再生医学等领域的研究热点。本实验通过分离培养兔脂肪干细胞，研究其成骨分化能力，探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 1．材料和方法 1.1材料 1.1.1 主要试剂和仪器 I型胶原酶（sigma 美国）；胰蛋白酶（sigma 美国）；地塞米松（sigma 美国）)；维生素C（sigma 美国）；β－甘油磷酸钠（sigma 美国）；高糖DMEM （GibcoGibeo 美国）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司杭州四季青生物工程材料有限公司）；碱性磷酸酶染色试剂盒（华美生物工程公司）；四环素（华美生物工程公司）；茜素红 （Amersco 美国）；EDTA（华美生物工程公司）；恒温CO2培养箱（Queue Systems Company 美国）；病理切片机（leica 德国）。 1.1.2 实验动物 4月龄健康新西兰大白兔（体重2.0－2.5kg，雌雄不拘，泰山医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:SCXK(鲁)2005一0005) 4月龄健康新西兰大白兔，体重2.0－2.5kg，雌雄不限。 1.2 方法 1.2.1 ADSCs的分离、培养及传代 4月龄健康新西兰大白兔，经耳缘静脉注射空气栓塞致死，取兔双侧腹股沟脂肪， PBS液冲洗剪碎，用I型胶原酶法进行消化，加入高糖DMEM培养液重悬浮，放入恒温CO2培养箱内培养，隔日换液，融合达90一95%后，倾倒原培养液，用PBS液轻缓漂洗贴壁细胞2次，尽量洗去残余血清，弃PBS液。在培养瓶中加入适量消化液(0.20%胰蛋白酶+0.02%EDTA)进行消化，吸管吸取培养液，反复轻柔吹打培养瓶底壁，使已经消化的细胞脱离瓶壁，吹打液1200 r/min离心10 min，弃上清。用培养液将沉积的细胞重新悬浮，接种于25cm2培养瓶中，传代比例为1：2，倒置相差显微镜下观察细胞形态特征及传代情况。 1.2.2 脂肪干细胞的成骨诱导培养 成骨诱导培养液的配制：DMEM培养液+ 10%胎牛血清+0.lumo1/L地塞米松+50mg/L维生素C+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+1%双抗 PH7.2－7.4，参照Zuk〔2〕等文献所述方法。 普通培养液：高糖DMEM培养液+10%胎牛血清+1%双抗（青霉素、链霉素） 取第3代ADSCs，以lx105/cm密度接种于24块盖玻片，置于37℃、体积分数为5 %的CO2饱和湿度培养箱内培养。待细胞长满后，其中12片作为成骨诱导组，加入成骨诱导液复合培养，行成骨诱导分化。12块作为对照组，加入普通培养液培养，共4周，每72 h换液1次。 待细胞长满后，其中12片作为成骨诱导组，改用成骨诱导培养基诱导分化，12块作为对照组，使用普通培养基培养，共4周，每72 h换液1次。 1.2.2.1碱性磷酸酶（ALP）染色 在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。1周后取出盖玻片，PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，滴加碱性磷酸酶染色液，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检。 1.2.2.2 茜素红染色 在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，加入1%茜素红溶液(PH值为8.3，Tris一Hcl配制)，37℃染色30分钟，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检 1.2.2.3 Von Kossa（钙结节）染色 在培养皿底部预置盖玻片，接种第三代细胞，以成骨诱导液培养，于37℃ 、5%ＣＯ2饱和湿度细胞培养箱内培养。4周后取出盖玻片，洗涤3次，4%多聚甲醛固定15分钟，PBS洗涤3次，加入5%硝酸银溶液，避光孵育30分钟，紫外灯下染色1小时，蒸馏水冲洗3遍，加入5%硫代硫酸钠作用5分钟，蒸馏水冲洗3遍，1%中性红复染5分钟，蒸馏水反复冲洗3遍，晾干后，甘油明胶封片，镜检。 2．结果 2.1 ADSCs体外培养的生物学特性 原代脂肪干细胞8小时开始贴壁，24小时完成贴壁，接种后可见部分悬浮呈圆形的血细胞混杂其中，轮廓清晰，细胞呈短梭形和多角形(图l)，5一7天融合达90-95%，约两周内可传代到第三代，细胞数量可扩增200-300倍，绝大多数细胞呈扁平的长梭形，局