基于细胞应激的核信号转导分析.doc

摘要 动物应激是以细胞应激为生理基础的，因此动物应激的基础研究应以细胞应激机理的部分理论为依据，而细胞核信号转导机理正是构成细胞应激理论的重要内容之一。从分子水平变化的角度综述了各细胞应激活性分子如nur77、nf-κb、hsp70和rip3等的出入细胞核机制，并以此为基础提出部分细胞应激核信号转导机制的猜想，为动物生产抗应激理论研究和预防提供一定思路。 　　关键词 细胞应激；活性分子；核信号转导 　　中图分类号 r363 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2016）03-0292-02 　　当细胞暴露于各种理化及生物性刺激时，任何生物细胞都将出现一系列适应代偿性反应，这些反应包括一系列非特异性反应，统称为细胞应激。动物体内的激素是一类化学信息分子，作用特定部位称为靶（target），包括靶器官、靶组织、靶细胞。除前列腺素外，疏水性信号分子经简单扩散入细胞后，与细胞内的相对应受体蛋白可逆结合，而该受体蛋白正好位于胞质和细胞核之间，从而引起受体蛋白构象翻转而发生核转位（nuclear translocation）。结合上配体并发生翻转和核转位的受体蛋白能与dna链上特殊应答基因启动子的相关反应元件结合，反式激活相关基因表达，这样就诱发出细胞的特定应答反应。此类受体蛋白是定位于核内的配体依存性转录激活因子，统称为核受体。细胞内形成的复杂基因网络存在多控制性，从而使得体内许多生理、代谢过程如生长发育、细胞分化等能协调表达出来。胞浆中合成的小分子蛋白质与大分子蛋白质分别以2种方式进入细胞核：分子质量小于60 ku的蛋白质为小分子蛋白质，其可自由通过核孔复合物（npc）在胞浆与胞核间穿梭；大分子蛋白质包括转录因子、核内蛋白质等，其无法自由进入细胞核，由可溶性转运受体介导转运，转运受体结合到运载物分子上的核定位信号（nls）和核转出信号（nes）。下文将简单介绍几种细胞应激信号核转导因子，以助于细胞应激这类基础研究的应用。 　　1 孤儿受体的细胞核定位作用 　　孤儿受体参与胆固醇及类固醇激素、糖类、脂类的代谢，对体内细胞基本功能进行调节的重要活性蛋白因子是较独特的核受体超家族中成员之一。已知人类至少有40个由不同基因编码的孤儿受体。孤儿受体的克隆，开拓了一个反向内分泌学的新领域，即先发现受体然后再找到的激素。研究较深入的孤儿受体家族有过氧化物酶体增殖因子激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors，ppars）、肝x受体（liver x receptor，lxrs）、孕甾烷x受体（pxr）、组成性雄甾烷受体（car）和法尼醇x受体（farnesol xreceptor，fxr）等。 　　nur77（又被称为tr33、ngfi-b或nr4a1-3）是nur孤儿受体超家族（包括3个家族成员：nor-1、nurr1和nur77）成员之一。最初nur77作为即时反应蛋白被克隆，其可被细胞外多种刺激信号诱导，这些信号以细胞特有方式调节生长、分化、凋亡等。nur77 可以被钙离子载体、依托泊苷（vp-16）、佛波酯（tpa）、人造鹅去氧胆酸衍生物、二丁基锡、镉、1，1二（3′-吲哚基）-1-（对苯）甲烷等物质快速诱导。但持续的nur77表达可诱导凋亡蛋白短暂的表达则不会发生凋亡。nls定位于nur77的dna绑定结构域，共有2个。通过神经生长因子，维甲酸可诱导nur77转位出细胞核，因此这2个nls可能与调节维甲酸信号相关。nur77的2个nls位于氨基酸序列残端278～283位（krrrnr）和308～313位（kgrrgr）上，第1个和第2个nls分别定位于第2个锌指结构内和a 盒内，这是nur77和dna绑定必需的序列。另外，nur77的配体绑定结合域包含3个nes，分别为aa408-417、aa467-476、aa520-530，在nur77从细胞核转移到细胞浆时发挥显著作用。nur77与其他核激素转录因子结合形成同源或者异源二聚体，从而起到调节生长和凋亡的作用。t细胞受体信号可诱导nur77的表达，并在其细胞凋亡中过度表达，可见nur77具有促进死亡作用。nur77对肿瘤细胞有促凋亡作用。此外从箭毒木中提取的毒性强心甾d可上调nur77的表达，且同时多种肿瘤细胞株的增殖受到有效抑制，这就间接说明nur77负性调节肿瘤增殖[1]。 　　研究表明，壳囊孢酮b可抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡，同时伴随着nur77的表达和线粒体的靶向转移[2]。同时也发现nur77在促凋亡时出现细胞亚单位之间的线粒体靶向转移现象[3]。因此，介导细胞凋亡的主要调控机制可能为nur77 的线粒体靶向转移活动[4]。nur77缺乏线粒体靶向转移序列，在nur77介导的细胞凋亡中，bcl-2作为促凋亡蛋白，触发细胞色素c释放与凋亡。bcl-2的表达具有保护细胞与破坏细胞2种表型，其发挥的具体作用由其所处的细胞背景决定。bcl-2的双重表型是由其蛋白构象调控的，nur77 可绑定在bcl-2的环上，并导致bh3 结构域暴露，从而使bcl-2的细胞保护作用转变为破坏作用。与此同时，nur77和bcl-b 结合最强烈，其可以改变bcl-b、bcl-2和bfl-1的表型，从而使它们转变促凋亡蛋白[5]。可见，靶向作用nur77-bcl-2通路具有抑制抗细胞凋亡调节和激活促凋亡作用，在细胞凋亡机制中起着重要调控作用。 　　2 核因子κb通路参与核信号转导 　　核因子κb（nuclear factor kappa b，nf-κb）通路是细胞的抑制蛋白可遮蔽nf-κb的nls，从而使其以非活性复合物形式被锚定于胞质内。研究表明，核因子κb（nf-κb）含有经典碱性nls。在抑制蛋白κb（iκbα）的第二锚蛋白重复区可能存在非经典nls，而iκb家族的另一成员bcl3的氨基端含有2个经典碱性nls。nf-κb出核并无nes，而在iκbα的羧基端含有一个富含亮氨酸的nes（c-nes）。nf-κb可以通过2条途径被激活。一是经典途径。由于微生物、病毒感染或者是炎症前因子等引起，通过刺激信号肿瘤坏死因子受体1/2、t 细胞受体和b细胞受体等使ikkα磷酸化，并作用于nf-κb二聚体（p50/p65）与iκb结合的复合物，iκb磷酸化从而激活nf-κb。二是旁路途径。b细胞活化因子受体和cd40受体刺激信号通过nf-κb诱导因子使ikkα磷酸化和前体p100磷酸化，经蛋白激酶作用诱导nf-κb/p100产生p52/relb异源二聚体，进入细胞核而参与一系列核转录。bcl-2与nf-κb关系密切。在人胚胎细胞和心肌细胞中，在bcl-2过表达细胞中，由于bcl-2的bh4保守区域特异性连接nf-κb，nf-κb的dna 锚定活性明显提高[6-8]。 　　3 hsp70参与核定位信号转导 　　热休克蛋白中的hsp70具有显著抗细胞损伤作用，并能抑制过氧化氢所致的细胞凋亡。核仁在细胞蛋白质的合成以及细胞生命活动中发挥重要作用。多种细胞核仁分离可被多种应激原诱导。正常状态下，hsp70主要分布于细胞浆中，只有能进入细胞核的热休克蛋白才能抗核仁损伤，才能探讨hsp70在氧化应激状态下的核及核仁移位。而缺失nls的hsp70δnls不能从细胞浆向细胞核及核仁移位而使得核仁分离。研究发现，在发生氧化应激时，hsp70δnls并没有使得细胞发生上述的核转位和核仁分离现象，细胞核仍继续受损，但通过nls介导后，hsp70δnls才发生上述的核转位及核仁分离，抑制核损伤。可见，nls才是hsp70发挥抗核仁损伤的关键部位[9]。热休克反应是经典的诱导hsps表达的应激原，它激活热休克因子1，并与热休克元件结合，从而启动下游基因的表达，包括多种hsps，如hsp70、hsp90、hsp25等。 　　4 rip3在细胞核信号转导的作用 　　rips是一类ser/thr蛋白激酶，与fas发生相互作用，于1995年stanger b.z等进行酵母双杂交试验时发现，被命名为受体相互作用蛋白，其具有一段保守的激酶结构域，许多细胞胁迫因子都会引发细胞生存环境改变，rip家族成员在这些刺激状况下发挥重要作用。不同成员在不同信号转导通路中的作用不尽相同。rips是一类重要的调节细胞生存或死亡的信号分子。rip激酶家族已经发现了rip1～rip7 7种蛋白，其具有一段同源性较高的ser/thr蛋白激酶结构域，可将底物上的ser/thr特异性的位点磷酸化。 　　rip3是一个激酶，具有能自磷酸化独特的c末端，这一c末端在caspase依赖的细胞凋亡通路发挥重要的作用[10]，如在tnf诱导caspase依赖性细胞凋亡。rip3在胰腺中高表达，并在肝、肾、脾、肺、胎盘、大脑、心和骨骼肌等多组织都有表达。rip3定位于细胞质，可在细胞核内外穿梭，在hela细胞中过量表达，其一级结构上有一段非经典的核定位信号――nls和三段核输出信号――nes1、nes2、nes3ⅰ和nes3ⅱ[11]，这3段均富含亮氨酸。其中nes1和nes2需要crm1（一种出核介导物）协助才能接到rip3出核，nes3介导出核时则不依赖crm1[12-13]。rip3主要的核输出方式是通过nes1和nes2来实现。研究发现，细胞在tnf刺激下，外源性的rip3需借助内源性rip3才能共共同定位在tnf-r1信号复合体上，然后使得rip1被磷酸化，进行nf-κb活化的调控[11]，由此可推测rip3具有诱导细胞凋亡的功能与其在细胞内的定位相关。 　　5 结语 　　综上所述，细胞受到应激信号刺激之后，首先引起核膜受体nur77发生翻转而启动nur77-bcl-2通路，进而与应激相关的因子发生相应变化和线粒体发生转移，前者导致nf-κb的dna锚定活性发生变化，调节细胞增殖、凋亡等的发生、发展；后者使得细胞内的氧化还原反应平衡受到破坏致ros产生量增加，这样多种活性因子被激活，其中就包括hsf1，进而hsp70的蛋白合成量增加，这样多余部分hsp70通过其nls进入细胞核内发挥抗核仁损伤作用。同时，氧化还原平衡被破坏后，细胞内的磷酸化平衡也相应受到破坏，引发rip3自磷酸化而使得细胞发生凋亡或坏死。因此，动物受到应激后，体内的生理平衡变为不平衡是以细胞受到应激刺激后，抗/促凋亡、坏死的稳态不能保持为基础的。 　　动物应激会导致机体内部各种活性因子发生变化，从而导致生理功能发生改变[14]。在应激或疾病条件下，早期炎症反应尤其是活化的白细胞就能显著增加ros的生成[15]。因此，氧化应激可定义为体内氧化与抗氧化失衡所致的一种病理状态。而找到抗动物应激的有效方法一直是近10年来多数从事家畜、家禽生产研究人员的一大夙愿，如采用添加高效抗氧化剂、中药提取物、多糖类免疫保健剂和抗生素等入饲料中，以提高动物抗应激能力，但存在或效用不稳定、或药物残留、或产生抗药性和成本太高等缺陷，这些问题的出现都迫切需要动物应激机理研究能有一定的广度和深度。就目前的研究来看，对试验动物和人类的细胞凋亡有一定的基础，但基本局限于医学基础研究如肿瘤细胞的凋亡坏死等，对家畜、家禽慢性应激导致的机体内正常细胞凋亡/坏死机理研究幅度和深度却略显苍白[16-17]，尤其是对细胞核信号转导研究得甚少，若能探明细胞应激的核信号转导通路，无疑可充实动物应激的科学理论研究，为动物生产过程中应激的预防提供一定应用依据和新产品开发思路。