土样中淀粉降解细菌的筛选[1].doc

土样中淀粉降解细菌的筛选（设计性实验） 一、实验目的 1. 掌握土壤样品中微生物菌种分离和筛选技术的实验设计方案。 2. 掌握富集、平板稀释涂布法、分离筛选产淀粉酶菌株的基本原理。 3. 初步掌握从土壤样品中分离筛选产淀粉酶菌株的基本技术。 二、实验原理 在自然条件下，产淀粉酶的细菌和其它各种细菌混杂生活在土壤中，要想分离出来必须建立相应的“筛子”。 淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物。葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 微生物酶产生菌的筛选具体分为增殖培养、初筛和复筛过程。增殖培养是通过控制培养基的营养成分和/或培养条件使样品中的目的菌得以大量繁殖,而非目的菌的生长受到抑制或繁殖减缓,从而提高样品中目的菌的数量和比例。初筛是对所得的纯种进行检测。由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养，再进行复筛。复筛的目的是淘汰底产菌。 三、实验材料 1、培养基：蛋白胨， NaCl，可溶性淀粉，琼脂，蒸馏水。 2、玻璃仪器: 培养皿10副，试管10支，三角瓶 6个，移液管 10支（1mL7支,10mL 3支），100mL量筒2个,玻璃棒，玻璃珠。 3、其它：酒精灯，硅胶塞,包装绳，包装纸,PH试纸，接种环，电子天平，称量纸,高压蒸汽灭菌锅，摇床，角匙，记号笔等。 四、方法与步骤 1、土壤样品: 食品厂、粮食加工厂、饭店等日常接触淀粉较多的肥沃土壤。 2、培养基的制备 (1)液体培养基：称取蛋白胨1.0 g、NaCl 0.5 g、可溶性淀粉0.2 g溶于装有100 mL蒸馏水的三角瓶中，调pH为7.2至7.4，分装为2个三角瓶,50mL/个,包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 (2)固体淀粉培养基：称取蛋白胨1.5g， NaCl 0.75g，可溶性淀粉0.3g ，溶于装有150 mL蒸馏水的三角瓶中，再加入3.0 g琼脂粉并搅拌至充分溶解，调pH为7.2至7.4，包扎，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 3、增殖培养 称取土样15 g，倒入盛有40 mL无菌水的带玻璃珠的三角瓶中，摇床振荡30 min制成土壤悬液, 用无菌移液管分别吸取10mL土壤悬液加入液体培养基中,置于37℃的恒温培养箱中培养24h。 4、初筛 浇注8块平板培养基。取增殖培养后的菌液标记为10－1。用无菌移液管吸取10－1的菌悬液1mL放入装有4.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0－2稀释液，照此分别制成l0－2～l0－4的稀释液。将10- 2～10- 4土壤稀释液1mL涂布于平板培养基表面,每一稀释度涂布接种两块平板。倒置于37℃的恒温培养箱中培养24h。待长出菌落后，滴加碘液，挑取有明显淀粉水解圈的单菌落，进行划线培养。 5、复筛 将10- 2、10- 3、l0－4初筛菌株稀释后在同一块平板上分别划线培养，于37℃恒温培养箱中培养20h，长出单菌落后滴加碘液,选择水解圈较大的菌株菌株即为所需菌株. 6、菌种鉴定 最后通过观察筛选到的菌株的菌落大小、形态，革兰氏染色和芽孢染色(方法详见微生物实验讲义实验四)等情况对筛选到的菌株进行初步鉴定。