哮喘豚鼠气道重构中基质金属蛋白酶(精).doc

哮喘豚鼠气道重构中基质金属蛋白酶     作者：王光辉，金发光，楚东岭，段丽 【关键词】  哮喘；气道重构；明胶酶B；金属蛋白酶1组织抑制剂     【Abstract】 AIM:  To investigate  the roles  of matrix metalloproteinase9  (MMP9)  and tissue inhibitor of metalloproteinase1 (TIMP1) in airway remodeling of asthmaric guinea  pigs. METHODS:  Guinea pigs  were sensitized with ovalbumin conjuncted with Al(OH)3， and subsequently challenged repeatedly with  ovalbumin  aerosol. The guinea  pigs  were  randomly divided into the control group，asthmatic 4, 6, 8week groups. The expressions of MMP9  and  TIMP1  in bronchi and lung tissues were observed by immunohistochemistry  combined with the microimage analysis．The levels of MMP9 mRNA  and TIMP1 mRNA  were determined by  semiquantitative PCR. RESULTS:  ① After  repeated allergen challenge, smooth  muscle  hyperplasia  was obvious  in guinea pig bronchi．Expression levels of MMP9  and  TIMP1 in the epithelial cells of bronchi were significantly higher in asthmatic animals  than those of control group． ② The expression of MMP9  in asthmatic guinea pigs  lung tissues was  0.52±0.05 in 4week  group, 0.74±0.05 in 6week group, 0.48±0.04 in 8week group , 0.21±0.04 in control group  （P<0.05）. The expression of  TIMP1 in asthmatic guinea  pigs lung tissues was 0.36±0.04  in 4week group,0.83±0.05 in  6week  group, 0.97±0.05  in  8week  group , 0.20±0.02  in control group  （P<0.05）. ③ The results of immunocytochemistry  were consistent with those of RTPCR. ④ The upregulation of MMP9 expression become  slower than TIMP1 since the 4th week in  asthmatic animals. So ratio of MMP9/ TIMP1  was decreased. CONCLUSION:  The expression levels of MMP9  and  TIMP1 were closely correlated  with asthma airway remodeling, and the ratio of MMP9/ TIMP1  may reflecte the degree of asthma airway remodeling.     【Keywords】 asthma;  airway remodeling; gelatinase B;  tissue inhibitor of  metalloproteinase1     【摘要】 目的： 探讨哮喘豚鼠模型中基质金属蛋白酶（MMPs）及其组织抑制因子(TIMP)在哮喘气道重构发病中的作用. 方法： 重复雾化吸人卵蛋白建立豚鼠哮喘气道重构模型. 实验分为对照组、哮喘激发4, 6 和8 wk组. 免疫组化方法结合显微图像分析检测MMP9, TIMP1的表达. 半定量PCR检测MMP9及TIMP1mRNA水平. 结果：  ① 哮喘各组动物均出现管壁增厚、平滑肌增生等气道重构的特征性改变. ② 哮喘豚鼠MMP9的mRNA表达：哮喘4 wk组为（0.52±0.05），哮喘6 wk组为（0.74±0.05）；哮喘8 wk组为（0.48±0.04）；对照组     为（0.21±0.04）；哮喘各组与对照组组间比较差异有统计学意义（P<0.05). 哮喘豚鼠TIMP1的mRNA水平： 哮喘4 wk组为（0.36±0.04）；哮喘6 wk组为（0.83±0.05）；哮喘8 wk组为（0.97±0.05）；对照组为（0.20±0.02）；哮喘各组与对照组组间比较差异有统计学意义（P<0.05）. ③ 免疫组化的结果和RTPCR的结果一致. ④ 在哮喘各时段组中，MMP9的表达增高自第4 wk时明显变缓，而TIMP1仍持续增高，导致MMP9/ TIMP1比例下降. 结论： 哮喘的气道重构与MMP9 和TIMP1的表达密切相关，而二者的比例可能反映气道重构的严重程度.     【关键词】 哮喘；气道重构；明胶酶B；金属蛋白酶1组织抑制剂     气道重构是气道反复炎症损伤与修复的结果，是造成哮喘患者不可逆气道阻塞的病理生理基础，主要表现为细胞外基质（extracellular  matrix,  ECM）的沉积、基底膜增厚、气道平滑肌增生和肥厚等改变. 其中ECM在气道壁沉积过多是引起气道壁纤维化和气流阻塞的主要原因之一［1］. 正常ECM的合成与降解处于一个动态平衡之中，基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinases, MMP9)与基质金属蛋白酶抑制因子1（tissue inhibitor of metalloproteinase, TIMP1）平衡是维持ECM内环境稳定的决定因素［2］. 本实验通过复制豚鼠哮喘模型,利用免疫组化和RTPCR方法测量不同阶段哮喘豚鼠模型肺中MMP9及TIMP1含量变化,并了解MMPs/TIMP在哮喘发病中的作用.     1材料和方法     1.1材料卵蛋白、结合生物素的羊抗兔IgG血清、ABC复合物均购自美国Sigma公司；兔抗TIMP1抗体、兔抗MMP9抗体购自武汉博士德公司；Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；Taq酶购自日本Promega公司；MMP9和TIMP1上下游引物由北京奥科公司合成；402型超声雾化吸入器购自上海合力医疗器械厂；PTC100型PCR仪为美国BioRab公司产品；雄性豚鼠32只，体质量200～250 g，由第四军医大学试验动物中心提供.     1.2方法     1.2.1动物分组及模型制备实验动物随机分为对照组和哮喘4， 6和8 wk组，每组8只. 各哮喘组于第1日腹腔注射卵蛋白(含等量氢氧化铝凝胶)0.1 mg，1 wk后雾化吸人10 g/L浓度的卵蛋白溶液激发哮喘，隔日1次，每次20 min，根据分组分别激发4，6和8 wk. 第1次激发后豚鼠即开始喘息，表现为呼吸加深加快，肋间隙凹陷，哮喘发作严重者可出现窒息；喘息后即将动物移出瓶外，喘息可持续30 min，甚至更长；对照组同样于第1日腹腔注射生理盐水0.9 mg，1 wk后将动物置于半封闭玻璃罩内雾化吸人生理盐水约20 min，隔日1次，雾化吸入生理盐水8 wk.     1．2．2动物模型肺组织取材、固定、切片各组模型于末次激发48 h后以戊巴比妥钠腹腔注射（40 mg/kg）麻醉豚鼠，开胸留取豚鼠左肺置于液氮中速冻，-70℃保存备用，经肺动脉灌注100 mL生理盐水,继以新配制的40 g/L多聚甲醛PBs（0.1 mol/L，pH 7.4）600 mL持续灌注90 min,并将右肺取下后固定24 h,入200 g/L蔗糖+含氟PB溶液中，4℃过夜至标本下沉，OCT包埋，恒冷箱切片机连续切片（厚15 μm），-20℃保存备用.     1．2．3免疫组化染色肺组织切片贴于载玻片上,室温干燥30 min后,以0.01 mol/L  KPBS(pH 7.4)浸洗,经800 mL/L甲醇+30 mL/L H2O2封闭15 min，KPBS浸洗3次×10 min,切片入兔抗MMP9血清(1∶100)室温孵育24 h. KPBS浸洗3次×10 min，入结合生物素的羊抗兔IgG血清(1∶500),室温孵育2 h，KPBS浸洗3次×10 min,入ABC复合物(1∶500)室温孵育2 h，葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺法显色. 显色反应终止后，常规脱水,中性树胶封片. 同样方法利用兔抗TIMP1染色切片. 每张切片在显微镜下随机选取5个支气管，以棕黄色颗粒在胞质的沉积为阳性. 图像分析各支气管细胞染色的平均密度以代表MMP9, TIMP1的表达强度. 1．2．4MP9及TIMP1半定量PCR用Trizol试剂提取备用肺组织总RNA；合成cDNA；半定量PCR反应体系：Taq酶33.34 nkat， Buffer 2 μL，dNTP (10 μmol/L)1 μL，MMP9上游引物(5′AAGGATGGTCTACTGGCACA3′)10 μmol/L， 0．5 μL，MMP9下游引物(5′GAAGATGAATGGAAATACGC3′, 10 μmol/L，）0.5 μL，模板1 μL，总反应体积20 μL. 反应条件：94℃ 1 min；56℃ 45 s；72℃ 1 min，35个循环. TIMP1引物：上游5′ACAGCTTTCTGCAACTCG3′，下游5′CTATAGGTCTTTACGAAGGCC3′，PCR产物长度为364 bp；条件：98℃，变性10 min，然后再94℃变性1 min，61 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环，最后，72℃延伸10 min. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像分析系统读取其灰度值.         统计学处理：  各组间数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行统计分析，采用ONEWAY ANOVA分析，组间两两比较采用SNKq检验，P<0.05为差异有统计学意义.     2结果     2.1哮喘动物模型的制作本实验中对照组豚鼠每次雾化吸人生理盐水均未见动物发生哮喘；各哮喘组第1次雾化吸人卵蛋白溶液可见哮喘发作，约激发3次可见明显哮喘发作，哮喘发作重者甚至可窒息致死.     2.2组织病理学改变各组豚鼠肺组织冰冻切片光镜下见：哮喘各组细支气管上皮变性，细胞脱落，支气管黏膜皱襞增多，肺泡隔增厚明显，并随着激发时间的增长逐渐增厚，在哮喘8 wk组表现最为明显. 对照组豚鼠肺组织支气管及肺泡结构正常(图1).     2.3MMP9及TIMP1在豚鼠模型肺组织的表达结果显示，哮喘各组与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中MMP9的表达6 wk组高于4 wk组和8 wk组(P<0.05)，4 wk组和8 wk组相比差异无统计学意义 (P>0.05). 在TIMP1的表达中，8 wk组均高于6 wk组和4 wk组(P<0.01)，