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网站客服:3074922707
技能
考核内容
细胞
鸡胚成纤维细胞原代培养
实验材料、用品
鸡胚:9-11日龄
器材:平皿、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、离心机、天平、离心管、100目不锈钢网、镊子、眼科小剪、细胞计数器、枪头、移液器等。
试剂:Hanks液、完全培养液、血清、碘酒、酒精
方法
1.取胚:取9-11日龄鸡胚,碘酒、酒精消毒气室部,去除气室部蛋壳,用无菌小镊取出鸡胚于无菌平皿中。
2.去头、爪、内脏,鸡胚组织Hanks液洗2次,除去红细胞,剪成1mm3组织块,用Hanks液洗2次,800rpm3min,去上清。
3.加2倍体积胰酶搅拌消化15-30min,分散好的细胞悬液加完全培养基,通过不锈钢筛网,滤液离心,沉淀加完全培养液,分散。
4.细胞计数,接种培养与分装:取单细胞悬液少量,进行1:5或1:10稀释后计数,然后调至细胞浓度为1x106/ml。
细胞计数方法:取细胞悬液,计数4角4个大方格细胞总数,用下式计数:
培养细胞的活性检查
材料
1.细胞
2. 0.4 % w/v trypan blue、75%乙醇。
3.培养瓶,无菌吸液管(5ml 及1m1)、废液瓶、盖玻片。
4. 倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、C02培养箱、超净台、枪头、移液器。
方法
1细胞悬液制备
1)选生长良好的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶,悬浮细胞碎片,吸出生长液,用Hanks液洗一次;
2)加入适量0.25%胰蛋白酶液,使消化液浸没细胞,置37℃培养箱,1min左右,镜检。
3)待细胞圆缩后,吸出消化液。
4)置37℃培养箱,随时镜检,。
5)待细胞变圆,加入完全培养基,洗下细胞,吹打混匀。
2取细胞悬浮液50ul与等体积trypan blue混匀。
3 取10ul混合液滴入血球计数板,于100 倍倒置显微镜下观察,活细胞不染色,死细胞则为蓝色。
4 计数:
培养细胞传代
材料
1.细胞培养物
2.Hanks液,0.25%胰酶,培养基
3.培养瓶、废液瓶、倒置显微镜、计数器、血球计数板、离心机、C02培养箱、超净台、离心管、枪头、移液器。
操作方法
1选生长良好的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶,悬浮细胞碎片,吸出生长液,用Hanks液洗一次;
2加入适量0.25%胰蛋白酶液,使消化液浸没细胞,置37℃培养箱,1min左右,镜检。
3待细胞圆缩后,吸出消化液。
4置37℃培养箱,随时镜检,。
5待细胞变圆,加入完全培养基,洗下细胞,吹打混匀。按1:2或1:3分配到培养皿中,补足培养液进行传代培养。
细胞冻存
材料
1.细胞培养物
2. 培养液、0.25%胰酶、冻存液、枪头、移液器、冻存管、记号笔、线绳、酒精灯、酒精棉球、液氮罐、冰箱、离心机、超净台
操作方法
1选生长良好的细胞一瓶,轻轻摇动培养瓶,悬浮细胞碎片,吸出生长液,用Hanks液洗一次;
2加入适量0.25%胰蛋白酶液,使消化液浸没细胞,置37℃培养箱,1min左右,镜检。
3待细胞圆缩后,吸出消化液。
4置37℃培养箱,随时镜检,。
5待细胞变圆,加入完全培养基,洗下细胞,吹打混匀。离心,细胞沉淀按(1-5)xl06/m1浓度,悬浮于冻存液中。
6.分装于冻存管中(l ml),严密封口,注明细胞名称和冻存日期。
7.冻存:每分钟下降1度。
冻存保沪液(10ml)
生长液 6.9ml
二甲基亚砜 1.0ml
小牛血清 2ml
双抗 0.1ml
细胞复苏
材料
1.冻存细胞
3. 培养液、抗生素液
4. 细胞计数器、吸管、冻存管、记号笔、线绳、培养瓶、酒精灯、酒精棉球等
5. 液氮罐、冰箱、恒温水浴锅、CO2培养箱、离心机、超净台、枪头、移液器
操作方法
1.取出冻存管 (取出时应戴好手套和防护眼镜),迅速放入37-40℃水浴中使其在l min 内融化(摇动)。
2.500-1000r/min低速离心5min,去上清。
3.加培养液悬浮,装入培养皿中,置37℃培养,次日更换培养液。
4.待细胞长成单层后即可传代。