抗体工程制药.doc

生物技术制药概括和研究进展 Ø 简述生物技术、生物药物和生物技术药物的概念 生物技术：利用各种生命系统，如各种生物有机体（包括微生物和动、植物）、其组成部分（包括器官、组织、细胞和细胞器）以及细胞内含物（包括核酸、蛋白质、多糖以及各种次生代谢物）来生产特定的生物产品。（The use of living systems, such as organisms, tissue cultures, live cells, or cell enzymes, to make a defined biological product） 生物药物：利用生物体内的初级或次级代谢产物、生物组织或整个生物体生产的用于预防、诊断或治疗疾病的医用品（来源于细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物的活性物质） 生物技术药物：利用DNA重组技术、单克隆抗体技术以及其他生物技术研制开发的蛋白质、抗体或核酸类药物 Ø 生物技术药物的种类及常见的生物技术药物是什么? 生物技术药物可分为：重组蛋白药物、治疗性抗体、核酸药物和其他生物技术药物 重组蛋白药物－细胞因子类：干扰素类，白细胞介素类，集落刺激因子类，肿瘤坏死因子类，红细胞生成素，生长因子类 －激素类：胰岛素，生长激素，降钙素，心钠素和利钠多肽家族 －溶血栓类：链激酶，尿激酶，葡激酶，组织型纤溶酶原激活剂 －可溶性受体（指细胞膜受体胞外与配体结合的膜外区，由于多种原因自胞膜脱落但仍保留和配基结合能力的受体）：肿瘤坏死因子可溶性受体，白细胞介素－1可溶 性受体，白细胞介素－4可溶性受体 －血液代用品：人血清白蛋白，血红蛋白 －导向毒素类：细胞因子导向毒素，单克隆抗体导向毒素 Ø 生物技术药物与传统药物相比有哪些重要特点? 特点：分子量大，分子结构复杂；存在种属特异性；用量小，活性强，相对其他药物副作用小、毒性低、安全性较高；不稳定，易变性，易失活，也易被微生物污染和酶解破坏；生产过程中，基因、生产菌株或细胞系以及生产条件的稳定性要求高，如发生变化将造成生物活性的变化；免疫原性：来源于动物的药物可在人中产生免疫和过敏反应；在人体内半衰期短，降解快，降解部位广泛；生物技术药物的批次间一致性和安全性的变化大于化学药品 生物技术制药与传统制药相比的优点：可使活性蛋白或多肽在各种生物反应器中高效表达，可获得天然来源难以得到的生理活性物质，使之成为新药，如人生长激素，胰岛素等；可获得足够数量的生物活性物质以对其结构、功能和性质进行深入研究，从而改造天然生理活性物质，提高生理活性，开发更多的新型生理活性物质；如对白介素2和tPA的改造；通过对微生物的改造，可获得新型化合物，扩大药物来源，如红霉素衍生物的研究。 Ø 简述生物技术药物研发的热点? 热点： Ø 应用基因工程抗体抑制肿瘤， Ø 应用导向IL-2受体的融合毒素治疗肿瘤， Ø 应用基因治疗法治疗肿瘤，如应用γ-干扰素基因治疗骨髓瘤。 Ø 自身免疫性疾病 Ø 冠心病 抗体工程制药 u 简述抗体药物的概念和特点。 概念：通过细胞工程和（或）基因工程方法制备的用于治疗的单克隆抗体、抗体片段、基因工程改造的抗体以及抗体免疫偶联物或抗体融合蛋白称为抗体工程药物，又称抗体药物（抗体的概念：由抗原诱导的淋巴细胞合成和分泌的具有特殊氨基酸序列和结构的免疫球蛋白分子） 特点： 特异性 Ø 与相关抗原的特异性结合 Ø 对肿瘤等靶细胞的选择性杀伤作用 多样性 Ø 抗原的多样性 Ø 抗体结构的多样性 Ø 抗体活性的多样性 Ø 免疫偶联物的多样性 制备时的定向性 Ø 针对特定的靶分子定向制备抗体药物 Ø 根据需要选择抗体药物的“效应分子” u 什么是单克隆抗体？简述制备针对特异性抗原的单克隆抗体的基本过程。 单克隆抗体：具有分泌抗体能力的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞经无性繁殖形成的细胞系分泌产生的活性、亲和力均相同的抗体（特点：抗体分子在Aa序列和空间构型上均相同，单抗具有高度的特异性，产生单抗的细胞系可长期传代并保存，可持续生产同一性质的抗体） 制备针对特异抗原的单克隆抗体：一般选40-50%的PEG 进行诱导（细胞融合后培养液中有脾-脾、脾-瘤、瘤-瘤、脾、瘤等细胞）；常用的选择性培养基为HAT培养基（瘤细胞是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏株）将经融合的混合细胞用HAT培养液悬浮稀释；一般在含有饲养细胞的96孔板中进行；在融合后7d用HAT选择培养基培养，7-14d用HT培养基培养，14d后用完全培养基培养；选择培养后，只有杂交瘤细胞才能生存（但不是所有的杂交瘤细胞均能产生所需的抗体）；产生特定抗原的抗体的B细胞只占所有脾细胞的5％左右；用抗原对所有小孔的培养上清进行抗体检测，筛出能产生目的抗体的杂交瘤细胞；将能产生目的抗体的培养小孔中的杂交瘤细胞进行稀释；可用有限稀释法和软琼脂法（有效稀释时，将细胞稀释液分加到96孔板中，使每个小孔在理论上只有一个细胞；软琼脂法）；培养后，取上清进行抗体检测，获得能产生目的抗体的杂交瘤细胞系；大量生产目的单克隆抗体 Ø 体外培养法，10 μg/ml Ø 动物体内诱生法， 5-20 mg/ml 小结：1. 用特定的抗原免疫动物；2. 从脾中取出B淋巴细胞，2. 骨髓瘤细胞；3. 获得杂交瘤细胞；4. 培养并筛选能产生抗体的单个杂交瘤细胞；5. 优化培养目的杂交瘤细胞；6. 纯化单克隆抗体 u 什么是基因工程抗体？有哪几种基因工程抗体？各种基因工程抗体的含义是什么？ 人－鼠嵌合抗体：在基因水平上将鼠源性单克隆抗体的可变区和人源性抗体恒定区连接起来并在适当的宿主细胞中表达形成的抗体 改形抗体：改形抗体又叫CDR移植抗体（CDR grafting antibody），将鼠单抗的CDR移植到人Ig分子的骨架区中换下其CDR序列而形成的抗体（具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性；抗体分子中鼠源部分只占很小的比例，可基本消除免疫原性） 镶面抗体：在人－鼠嵌合抗体的基础上将来自鼠单抗可变区中决定免疫原性的暴露于抗体表面的Aa用相应位置的人Ig的Aa代替而形成的抗体（理论基础：抗体表面所暴露的Aa位置和数量都很保守，不因种属和型别而改变；抗体表明暴露的Aa是鼠源可变区免疫源性的主要来源） 小分子抗体：（优点：分子质量小，免疫原性低；易于进入实体瘤周围的微循环甚至进入实体瘤的内部；无Fc片段，不易与具有Fc受体的非靶细胞结合，用于免疫诊断时成像清晰，本底低；构建较简单，易于操作和改造；可在细菌中表达，易于大量生产；可与多种效应分子如毒素、前体药物转化酶等构建多种双功能抗体分子 缺点：多为单价抗体，与抗原结合活性相对较弱；半衰期短，能很快从血液中清除，从而可能影响治疗底有效浓度） u 简述抗体在制药中的重要用途和发展趋势 抗体的主要用途： Ø 器官移植排斥反应的逆转(Orthoclone) Ø 肿瘤免疫诊断，肿瘤免疫显像，肿瘤导向治疗 Ø 哮喘、牛皮癣、类风湿性关节炎、红斑狼疮、急性心梗、脓毒症、多发性硬化症及其他自身免疫性疾病 Ø 分子瘤苗治疗肿瘤 Ø 多功能抗体（双特异抗体、三特异抗体、抗体细胞因子融合蛋白、抗体酶等）的特殊用途 发展趋势： Ø 寻找新的分子靶标 Ø 抗体人源化 Ø 抗体药物的高效化 Ø 抗体药物分子的小型化 Ø 抗体融合蛋白 动物细胞制药 u 什么是动物细胞制药？ 利用动物细胞体外培养和扩增来开发、测试和生产药物的工程技术，属于动物细胞技术（animal cell technology）或称动物细胞工程（animal cytotechnology) u 动物离体培养细胞根据培养特点可分为哪几种类型？根据获得途径不同又可分为哪几类？ 分类 ---贴壁依赖型（anchorage-dependent）：贴壁细胞 Ø 培养过程中依靠自身分泌的或培养基中的贴附因子才能在支持物表面生长、增殖 Ø 可来源于中胚层细胞，如成纤维细胞、心肌细胞、平滑肌细胞和成骨细胞；贴壁生长后呈成纤维细胞型形态，细胞呈梭形或不规则三角形 Ø 可来源于外胚层和内胚层，如表皮细胞、上皮细胞等；贴壁生长后呈上皮样细胞型形态，细胞呈扁平的不规则多角形 ---非贴壁依赖型（anchorage-independent）：悬浮细胞 Ø 可在培养液中悬浮生长，不依赖于支持物表面 Ø 如血液中的淋巴细胞 Ø 生产干扰素的Namalwa细胞 Ø 细胞呈圆形 ---兼性贴壁细胞 Ø 可贴附于支持物表面生长，也可在培养基中呈悬浮状态生长 Ø 如CHO细胞、小鼠的L929细胞 Ø 当贴附于支持物表面生长呈上皮或成纤维细胞型 Ø 当悬浮培养时呈圆形 根据获得途径分： ---原代细胞 Ø 直接将动物的组织、器官经破碎等处理后获得的细胞悬浮液 Ø 1g组织约有109个细胞 Ø 需要大量的动物，费钱费力 Ø 用得最多的如鸡胚细胞、兔肾或鼠肾细胞、以及淋巴细胞 ---二倍体细胞系 Ø 原代细胞经传代、筛选、扩增，从多种细胞成分中挑选并纯化出的某种具有一定特征的细胞系 Ø 染色体的核型仍然是2n Ø 具有明显的贴壁依赖和接触抑制的特性 Ø 只有有限的增殖能力 Ø 无致瘤性 ---转化细胞系 Ø 细胞在某种转化过程中，常常由于染色体的断裂变成了异倍体，从而失去了正常细胞的特点，获得了无限增殖的能力 Ø 可自发；可用病毒或化学试剂诱导；还可以从肿瘤组织中获得 u 用于动物离体细胞培养的培养基有哪几种？什么是无血清培养基？ 分类： 天然培养基：血浆凝块；血清；淋巴液；胚胎浸液；羊水；腹水（早期使用，成分复杂，组分不确定，来源有限） 合成培养基；氨基酸，维生素，糖类，无机盐，核酸前体，氧化还原剂，动物血清（提供生长因子和激素，提供贴附因子和伸展因子，提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白，提供脂肪酸，提供微量元素）（成分明确，组分稳定，可批量生产） 无血清培养基：在合成培养基中加入不同种类的添加剂后而形成的适于大规模细胞培养的培养基。添加剂：激素和生长因子，结合蛋白，贴附和伸展因子，其他有利于细胞生长的因子和元素（提高了细胞培养的可重复性；减少了由血清带来的各种微生物的污染；可工厂化生产，供应充足、稳定；细胞产品易于纯化；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；便于产品的检测） u 简述用于动物离体细胞培养的方法。 ---悬浮培养：将细胞自由地悬浮于培养基内生长增殖，适用于非贴壁依赖性细胞、兼性贴壁细胞（优点：操作简单，培养条件均一，传质和传氧较好，易于扩大培养；缺点：细胞的培养密度较低） ---贴壁培养：将细胞贴附在某种基质上生长培养，适用于一切贴壁依赖型细胞，兼性贴壁细胞（优点：适用的细胞种类多，易采用灌流培养，可使细胞达到高密度；缺点：操作麻烦，需要合适的贴壁材料，培养条件不一，难控制） ---贴壁-悬浮培养：分 Ø 微载体培养 Ø 包埋培养：细胞被包埋或包裹在凝胶载体中 Ø 微囊培养：将包埋的颗粒经液化处理而成为微囊 Ø 结团培养：以细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方式进行培养 基因治疗和核酸药物 u 什么是基因治疗？世界上第一个批准的用于基因治疗的药物是什么？ 基因治疗：通过改变病人遗传基因来治疗疾病的任何治疗方案或药物（“Any procedure intended to treat or alleviate disease by genetically modifying the cells of a patient” ） 2004，重组人ｐ５３腺病毒注射液（商品名：今又生） u 简述各种基因治疗方法的含义。 ---基因置换（gene replacement）：用正常基因原位替换病变细胞内的缺陷基因（细胞内的