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成年小鼠心脏灌流.docx
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成年 小鼠 心脏 灌流
成年小鼠心脏灌流 实验材料:需要观察脑切片的小鼠 试剂/试剂盒:乙醚;生理盐水(37℃水浴);4%PFA;30%蔗糖 仪器:蠕动泵;剪刀;镊子;针头;导管 实验步骤: 1、准备实验器材:两个锥形瓶(1个装生理盐水,一个装4%多聚甲醛,记得要用封口膜封口) 2、用生理盐水冲洗导管,并排除管内气体。(灌流时选用雄性动物比选用雌性动物要好,原因是雌性动物受其激素周期影响,雄性的结果更为可靠) 3、在密闭容器内加适量乙醚,麻醉小鼠。(需要注意的是,小鼠清醒一点比死掉要好,防止血液凝固给灌流带来阻力) 4、待小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上(用针头插住四肢)。 5、一只手用镊子扯起胸部皮肤,另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨,暴露出心脏和肝脏。 6、将注射针头插入小鼠左心室(如针头不稳可用镊子将其固定在泡沫板上),同时将小鼠肝脏减掉,以使血液流出。灌流速度5.8rpm。(灌注生理盐水的时间维持在10min左右,血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白) 7、对小鼠进行剪尾取样,以备测定其基因型。同时,将小鼠信息卡片上记录灌流信息,并将灌流小鼠的信息记录在自己的实验记录本上,以方便后续的重新基因型鉴定操作。 8、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后,将导管始端从生理盐水中拿出,将其放入冰浴的4%PFA溶液(4℃)中,用4%PFA灌流固定时,当PFA流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象(有时可能没有),此时可将灌流速度由5.8rpm调至4.8rpm,以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为20min。(固定原理:多聚甲醛可以使蛋白质交联) 9、将导管始端从PFA中拿出,待管中液体流尽后,将心脏上的针头拔下,如果固定的较好,可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内,并准备下一步的取脑操作。 10、拿出一条纸巾,将小鼠尸体放在上面,沿颈部剪下头颅。 11、剪开头部皮肤,露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开,除去多余的结缔组织。需要注意的时,眼睛要由剪刀剪下,不能够直接扯下来,因为眼睛后部连着视神经,如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 12、将头盖骨小心剥开,露出白色的脑部,在剥嗅球部位时要格外小心,必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 13、将头盖骨剥开后,将脑下部连接的神经逐条剪短(可看到视神经交叉),待全部剪断后将脑整个剥离出来。 14,将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中,过夜固定。 15、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水(防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞),初始脱水时脑会浮在蔗糖上面,待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。

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