感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌).doc

感受态细胞的制备（DH5α） 一、 准备工作 所有试剂、容器均需提前预冷。 1、实验器械 4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。 2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧） ① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。 ② SOB培养基（Super Optimal Broth） ③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存） ④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。 终体积 TFB1 浓度 100ml 200 ml 250 ml 1L KAc KCl CaCl2 MnCl2·4H2O Glycerol 30 mM 100 mM 10 mM 150 mM 15% 0.249g 0.146g 0.111g 0.99g 15ml 0.588 g 0.292 g 0.223 g 1.98 g 30 ml 0.623 g 0.365 g 0.278 g 2.475g 37.5 ml 2.49 g 1.46 g 1.11 g 9.9 g 150 ml 先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用0.2 M醋酸调pH值至5.8（非常关键），用针式过滤器过滤除菌，4度保存。 TFB2 浓度 20ml 200 ml MOPS CaCl2 KCl Glycerol 10 mM 75 mM 10 mM 15% 0.042g 0.164g 0.015g 3ml 0.42g 1.64 g 0.15g 30 ml 先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用1 M KOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，放在冰上当天现配现用 SOB培养基 配制量 1 L 配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。 2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装） 在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。 3.称取下列试剂，置于l L烧杯中。 Tryptone 20 g Yeast Extract 5 g NaCl 0.5 g 4.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。 6.滴加NaOH小块，调节pH值至7.0。 7.加入去离子水将培养基定容至l L。 8.高温高压灭菌后，4℃保存。 9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。 LB培养基 配制量 1 L 配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。 Tryptone 10 g Yeast Extract 5 g NaCl 10 g 2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。 3.滴加固体 NaOH，调节pH值至7.0。 4.加去离子水将培养基定容至1 L。 5高温高压灭菌后，4度保存。 二、 实验步骤 1、第一天：下午3点取出-80°的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul的LB中再稀释，取100ul涂板。37度恒温箱培养过夜约16h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。 2、 第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入5ml高压过的SOB培养液，标注为对照管和DH5α管。从LB平板上挑取单个菌落加入DH5α管中，220rpm，37℃，5h，OD550达0.3，将5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，3.5h后，OD550达0.36（T43.7%），取出冰上放置5min； 3、 将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin 3K,5’,4℃，倒净上清，倒置于吸水纸上吸干剩余上清。之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔; 4、 每管加入20ml TbfI 重悬，轻柔操作，冰上放置5’, spin 3K,5’,4℃。倒去上清，并倒置于吸水纸上; 5、 每管加入2ml Tbf ll 重悬，轻柔操作，冰上放置15’; 6、 每管50ul 分装。液氮速冻，-80度储存，标明制作日期，细菌种类; 7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗Kana的质粒，分别涂布含AMP，含Kana的板子，第二天验证感受态状态。 8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP，含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana的质粒后分别后分别在含AMP，含Kana的板子中生长。（每个都需涂2个板，含AMP，含Kana的板子）