干细胞研究进展.doc

分 子 免 疫 学 课 程 论 文 干细胞研究进展 张现宁 （山东农业大学，生命科学学院，山东 泰安 270000） 摘要：干细胞是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，是各种组织器官的最初来源。通过几十年的研究发展，干细胞工程已经广泛应用于生命科学及医药学中的多个领域。目前研究的干细胞种类众多，本文综述了干细胞的来源、基础生物学特征和应用，以及胚胎干细胞和成体干细胞的研究进展。 关键词：干细胞 来源 生物学特征 胚胎干细胞 成体干细胞 前言：干细胞如同植物细胞或组织经组织培养后再生新植株一样，能够分化形成一个新的动物生命体。这打破了科学界对细胞的命运在胚胎期就已经确定并不可逆转的认识，为动物组织器官的再生提供了可能性，也为器官移植提供了新的来源，并且对攻克人类重大疾病如心脑血管疾病、癌症、老年性疾病等提供了新的方法和思路。20世纪90年代以来，分离和体外培养各种来源的干细胞技术不断成熟，干细胞生物学研究激起了生命科学界强烈反响，世界各国都专门设立专项用于干细胞的研究,有关干细胞的理论也不断被完善。 1 干细胞基础 1.1 干细胞的来源与发展 干细胞（stem cell ,SC）是一类具有自我更新和增殖分化能力的细胞，能产生表现型和基因型与自己完全相同的干细胞。干细胞这个词最初是在19世纪的生物学文献中出现，1896年，E.B.Wilson在论述细胞生物学文献中第一次应用干细胞一词，专门用以描述存在于寄生虫，如蠕虫、线虫、蛔虫等生殖系的祖细胞。1983年，Sulston在文献中记录，从对线虫细胞系研究中，表明生殖系祖细胞的早期细胞分裂物仍保持有关亲代分裂球特性，并证明具有自我更新能力。这种观点与目前所认识的干细胞特性较接近。1967年，美国华盛顿大学的多纳尔·托马斯发表论文称，如果将正常人的骨髓移植到病人体内，可以治疗 造血功能障碍，从而开始干细胞应用于血液系统临床疾病治疗。1998年11月，美国科学家Thomason在“科学”杂志上报道，他们成功地在体外培养和扩增了人体胚胎干细胞。由于胚胎干细胞可以在一定条件下分化成各种组织，所以，可能被用来取代病人体内坏损的组织细胞，达到治病的目的，从而带动了世界范围内干细胞研究的热潮。一年后的1999年3月，美国科学家Goodell发现小鼠肌肉组织干细胞可以横向分化成血细胞。这一发现立即被世界各国科学家证实，并且发现，人成体干细胞同样具有横向分化功能[1]。自21世纪以来，世界各国纷纷投入大量资金用于干细胞研究，其研究种类众多，发展迅速，理论和技术被不断完善。1999年，《Science》将干细胞研究评为21世纪最重要的10项研究领域之首，2007年三位科学家因在胚胎干细胞与哺乳动物DNA重组方面的研究而获得诺贝尔医学和生理学奖，2012年，日本科学家山中伸弥和英国科学家约翰·咯噔因在在体细胞重编为干细胞方面的研究而获得诺贝尔医学和生理学奖。在未来中干细胞依旧是生命科学与医学领域的研究热点，终将为人类重大疾病的根治提供新的技术支持。 1.2 干细胞的生物学特性 1.2.1 干细胞的生化和形态特性：各种干细胞在形态上有一些共性，细胞较小，通常呈圆形或椭圆形，核质比较大。细胞核染色质分布较弥散，核仁较明显。细胞质内除含有游离核糖体外，其它细胞器均少且小。不同种类的干细胞生化特征有所差异，但都具有比较高的端粒酶活性，这与其增殖能力密切相关。 1.2.2 干细胞的增殖特征：干细胞的增殖具有缓慢性和自稳定性。缓慢性是干细胞进入分化程序之前，首先要经过一个短暂的增殖期，产生界于干细胞与分化细胞之间的过渡放大细胞，经若干次分裂后产生分化细胞。这样有利其对特定的外界信息作出反应，以决定其是进行增殖或是进入特定的分化程序，还可以减少基因发生突变的危险，使其有更多时间发现和校正复制错误。自稳定性是干细胞可以在生命个体中自我更新和维持数目的稳定。干细胞分裂时，如两个子代细胞都是干细胞或都是分化细胞时，称对称分裂；如产生一个子代干细胞和一个子代分化细胞时，则称不对称分裂。对无脊椎动物而言，不对称分裂是干细胞维持自身数目恒定的方式。但是，大多数哺乳动物可自我更新的组织中，干细胞分裂产生的两个子代细胞既可能是两个干细胞，也可能是两个特定分化细胞。当组织处于稳定状态时，每一个干细胞产生一个子代干细胞和一个稳定分化细胞。因此，哺乳动物的干细胞是种群（而不是单个干细胞）意义上的不对称分裂，称种群不对称分裂。这样使得机体对干细胞的调控更具有灵活性，可以更灵活地应对机体生理变化的需要[2]。 1.2.3 干细胞的可塑性：干细胞的可塑性一般指的成体干细胞，即特定部位的成体干细胞有分化为发育上无关的细胞组织的潜力。一种组织类型的干细胞在适当条件下可分化为另一种组织类型的细胞，称干细胞的横向分化。干细胞的微环境对其转化具有非常重要的作用，一些内在和外在的信号调节着这些干细胞的命运，这具有重要的理论意义和实用价值，将为干细胞定向培养和应用带来新的前景。 1.2.4 干细胞增殖与分化的微环境：干细胞生存在一定的微环境中，这种微环境称干细胞壁龛（niche）, 在壁龛中，所有控制干细胞增殖与分化的外部信号构成了干细胞生存的微环境。在高等脊椎动物，干细胞生存的微环境在维护干细胞自我更新、决定干细胞分化命运至关重要，但是干细胞微环境对干细胞命运的设定并不是不可逆的。当干细胞被置于新的生存环境后，干细胞的特性会发生改变而带有新环境的烙印，从而体现出干细胞的可塑性[3]。 1.3 干细胞的应用及难题 综合来看，干细胞的应用主要分为两部分：胚胎干细胞的应用和成体干细胞的应用。胚胎干细胞用于生产转基因动物和克隆动物、发育生物学研究、新型药物研究和组织器官的修复治疗研究;而成体干细胞的研究主要用于治疗疾病及组织的再生，如用造血干细胞治疗白血病、间充质干细胞治疗软骨病、神经干细胞治疗帕金森综合症等；用于干细胞的横向分化研究；肿瘤干细胞及肿瘤治疗的研究[4]。 干细胞应用研究主要集中在以下几个热点领域：①帕金森综合征、脊柱损伤等疾病；② 心脏病；③ 糖尿病；④ 肝脏疾病；⑤ 烧伤和皮肤溃疡；⑥ 眼科疾病；⑦ 肌肉萎缩等。上述疾病基本上都是既往传统医学认定的疑难病或者缺乏特效疗法的疾病。 尽管干细胞的研究给人类疾病的治疗带来了福音，但却面临很多问题。主要有：因为干细胞在组织中仅存在微量而无法大量获得；如何定向诱导干细胞的分化及如何选择诱导分化所需的微环境；由胚胎干细胞的研究而引发的一系列伦理问题；临床应用或实验结果的准确性存在不严谨现象；一些学者为达到某些目的而夸大或造假；政府对干细胞方面的研究没有系统的管理政策[5]。 2 干细胞分类及研究进展 干细胞具有自我更新的能力，在一定条件下，可分化成各种功能细胞。干细胞按其分化潜能的大小可分三种类型：①全能性干细胞即具有形成完整个体的分化潜能，如胚胎干细胞可无限增殖并分化成为全身200多种细胞类型，进一步形成机体的所有组织器官；②多能性干细胞即失去发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定限度，如骨髓多能干细胞可分化出至少12种血细胞，但不能分化出造血系统以外的细胞；③单能干细胞即只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，如上皮组织的基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞。 通常将干细胞分为胚胎干细胞和存在于成熟个体组织器官内的成体干细胞。 2.1 胚胎干细胞 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC）是一种从哺乳动物早期胚胎的囊胚内细胞团细胞经分离、体外抑制分化培养得到的具有发育全能性( 或多能性) 的一类干细胞。与已经成熟分化的体细胞一样，ES细胞也是一分为二地分裂增殖，且ESC具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。在一定的培养条件下，ES细胞可以在体外长久和稳定地自我复制。无论在体外还是体内环境，ES细胞都能被诱导分化为内、中、外3个胚层的几乎所有类型细胞。ES细胞的发现始于研究胚胎瘤细胞，而有关人胚胎干细胞研究最多的是从囊胚期内细胞群中直接分离胚胎干细胞。 2.1.1 胚胎干细胞的生物学特性 ES细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构，细胞体积小，核大，核质比高，有一个或多个明显的核仁，核型正常，具有整倍性。在体外分化抑制性生长时ES细胞呈克隆状生长，细胞紧密聚集在一起，形似鸟巢，细胞界限不清，用碱性磷酸酶染色，ES细胞呈棕红色，而周围的成纤维细胞呈淡黄色。ES细胞具有正常的二倍体核型和高度分化潜能。在体外需在饲养层细胞或抑制分化因子作用下才能保其未分化状态，一旦脱离饲养层就会自发地进行分化。在不同物质、不同刺激因素的作用下，ES细胞可向不同方向分化，表现出高度分化潜能。 时相专一性胚胎抗原Oct-4基因的表达蛋白为ESC发育全能性的标志，另外，ES细胞中 AFP及端粒酶活性较高，可用于ES细胞分化与否的鉴定。 2.1.2 胚胎干细胞的研究进展 目前ES细胞主要研究方向是不同哺乳动物ESC的建系和体外定向分化。 ES细胞建系，来自由分离的内细胞群细胞、从5-9周的胚胎生殖腺中分离ES细胞；也用克隆技术将体细胞核移植到去核卵母细胞中，使之发育成囊胚，再分离其内细胞群细胞，由这种方法获得的细胞或组织，遗传物质和供体一致，故移植后不会产生免疫排斥反应。1981年，Evans等首先建立了小鼠的ES细胞系，在此之后近20年里，人们相继自早期胚胎建立了仓鼠、猪、兔、水貂、大鼠、鱼类、鸟类、牛、灵长类动物(恒河猴、狨)和人的类ES细胞系。 ES细胞的培养体系主要分为含饲养层细胞培养法和无饲养层细胞培养法。含饲养层细胞培养法中常用的饲养层为小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF），不过由于存在异体污染的风险，科技人员更多选择开发用于无饲养层细胞培养的培养液。目前已经有较多商业化的无饲养层、无异源污染的成分明确的培养液出现，但是已被报道可用于HES建系的培养液仅有TeSR1，尚处试验阶段未被商业化. ES细胞可在体外定向诱导为多种细胞类型，如神经细胞、成骨细胞、脂肪细胞等。其诱导方法有很多，常用的有：外源性生长因子诱导ES细胞分化、转基因诱导ES细胞分化、ES细胞与其他细胞共培养的方式诱导ESC分化。并且ES细胞的分化受内源性因素和外源性因素的共同调节。 ES细胞及其体外分化模型能够模拟胚胎正常发育进程，在发育生物学、转基因动物的生产、克隆动物、动物和人类疾病模型的建立、药物的开发和筛选、基因治疗、细胞组织和器官的修复和移植治疗等方面都有广泛的应用前景[6]。 2.1.3 胚胎干细胞面临的问题 在ES细胞的研究中，仍然存在着许多问题，如诱导分化效率低、定向细胞分离和纯化困难、培养条件滞后、定向分化的机制、临床应用与转基因的安全性、交叉污染、免疫排斥等，但最主要的还是涉及到的伦理问题。 人胚胎干细胞的来源大约有四种：①人工流产后的人类胎儿组织；②通过体外受精产生的人类胚胎；③用捐赠者的配子通过体外受精产生的人类胚胎；④通过体细胞核转移技术以无性生殖方法产生的人类胚胎，这一项遭到强烈的反对。围绕胚胎干细胞研究的伦理道德问题，主要包括人胚胎干细胞的来源是否合乎法律与道德，其应用是否会引起伦理及法律问题，引起的争议已成为世界性的话题。禁止生殖性克隆已成为普遍共识，而治疗性克隆的研究被多数科学家所认同。伦理问题将是制约ES细胞研究发展的最大障碍。 2.2 成体干细胞 成体干细胞（adult stem cell,AS）长期以来没有一个明确的定义。传统的观念认为，成体干细胞是存在于成熟个体组织器官内的干细胞，具有不断增殖、自我更新和组织特异性定向分化潜能的一类特殊细胞群体。2001年，斯坦福大学的Blau提出一个全新的成体干细胞概念：成体干细胞是一种细胞状态，它可以来自许多不同类型的细胞，包括已分化细胞，它不只是存在于特定组织中，还可以通过过血液循环到达躯体各处，参与各种组织的修复和再生。即使是高度分化的组织细胞，如多核肌细胞和中枢神经细胞也能逆转其分化状态成为干细胞。现在