干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究.doc

项目名称： 干细胞分裂模式和干细胞干性维持的机制研究 首席科学家： 高维强 上海交通大学 起止年限： 2012.1至2016.8 依托部门： 教育部 上海市科委 一、关键科学问题及研究内容 (一) 拟解决的关键科学问题 面对我国生命医学科学的重大需求和干细胞研究的挑战，结合我们前期的研究基础，本项目拟重点围绕干细胞分裂模式的发生、调控和动态机制及其在正常和病理过程中的意义这一核心内容，解决如下关键科学问题： 1. 以对称和不对称分裂为新的切入点，研究哺乳类组织干细胞干性维持这一重要生物学课题。 2. 从机理上阐明对称和不对称分裂、细胞周期、miRNA、蛋白质修饰之间的关系，及其如何调控干细胞的干性维持。 3. 发现新的调控干细胞对称和不对称分裂的关键分子，为临床疾病的诊治提供线索。 (二) 主要研究内容 1. 干细胞分裂模式对干细胞干性的调控机制：观察哺乳类上皮组织(前列腺、脑、内耳)在发育及病变过程中的干细胞分裂模式，研究及验证已知的和新发现的不对称分裂的关键分子的调控机理及其作用，包括与特异信号转导通路分子的关系。 2. 细胞周期调控干细胞干性的获得及其机理：从干细胞多能性获得与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理着手，结合影响细胞分裂模式、细胞周期变化的关键因子研究，从干性获得的角度逆向解读干细胞的干性与细胞周期、分裂模式之间的关系与调控机理，并在此系统中研究关键因子通过调节细胞周期来决定细胞命运的可能机制。 3. miRNA和蛋白质修饰在干细胞对称和不对称分裂过程中的作用及机理：分析miRNA 302/367集群、let-7和组蛋白修饰HDAC对干细胞分裂模式调控干细胞干性获得和维持的影响；鉴定let-7缺失、miRNA 302/367集群表达和HDAC抑制诱导多能干细胞的特异靶信号基因；利用miRNA启动子报告体系验证新旧调控干细胞对称不对称分裂的关键分子对干细胞干性获得和维持的作用；利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析组蛋白修饰与干细胞对称和不对称分裂的关系。 4. 运用果蝇和线虫研究调控干细胞对称和不对称分裂的新机制:筛选调控对称和不对称分裂的新因子，利用遗传学、细胞生物学、生物化学及分子生物学等方法，在果蝇和线虫中阐述这些新因子的作用机制及调控网络，为哺乳类干细胞对称/不对称分裂机理研究提供新的研究方向及理论依据。 二、预期目标 （一）总体目标 瞄准国家战略需求和国际干细胞科学研究前沿，针对干细胞对称和不对称分裂调控干细胞干性获得和维持这一核心问题，运用哺乳类上皮干细胞、类器官体外重建体系、诱导多能干细胞重编程体系和病变组织培养等体系和方法，系统研究干细胞对称和不对称分裂、细胞周期、miRNA、蛋白质修饰与干细胞干性维持之间的相互关系，阐明其如何通过特异的信号通路影响干细胞的干性维持，揭示干细胞不对称分裂和细胞周期在组织发育、再生修复及病理变化过程中的作用机制；运用果蝇和线虫等模式动物，验证调控干细胞对称/不对称分裂的关键分子的整体功能，并探寻新的因子，分析其在哺乳类的同源功能和分子机制，完善和建立哺乳类干细胞分裂模式的分子机理模型。通过本项目的实施使我国在干细胞干性维持研究的相关领域达到国际领先水平。同时，以本项目实施为契机，促进干细胞生物学、发育生物学、遗传学、生物化学、影像学研究的衔接和拓展，培养一批优秀的交叉学科研究人才。 （二）具体目标 1. 以哺乳类组织为研究对象，运用前列腺、脑、内耳体外培养系统，采取高分辨显微技术，实时追踪干细胞分裂模式，解析分裂模式与干细胞干性维持在正常发育和组织病变过程中的分子生物学作用及意义。 2. 全面分析重编程整个过程中的细胞周期变化及其分裂模式，并在此系统中研究关键因子通过调节细胞周期来决定细胞命运的机制。 3. 阐明特异miRNA、蛋白质修饰相关因子、信号转导途径和基于果蝇和线虫模式动物中已知的和新发现的关键分子之间的相互作用关系，描绘它们调控干细胞干性维持的机制图。 4. 利用果蝇和线虫模式动物遗传学筛选平台，发现若干新的调控干细胞分裂模式和干细胞干性维持及获得的关键分子，确定与哺乳类相应的同源基因在前列腺、脑、内耳组织中的作用。 5. 取得具有国际影响的原创性成果，在国际重要学术刊物上发表高水平论文 30-50篇。在Cell、Nature、Science及其系列杂志上发表3至5篇国际顶级学术论文。申请专利 10项。 6. 培养国家杰出青年基金获得者1-2人，培养一批具有国际竞争力的优秀中青年研究人员和后备人才，为我国干细胞分裂模式和干细胞干性维持研究的高水平、可持续发展提供支撑。 三、研究方案 (一) 学术思路 干细胞干性维持包括自我更新及分化潜能，与分裂模式直接相关。干细胞对称和不对称分裂是干细胞干性维持的核心问题，通过对称分裂扩充干细胞池或分化的细胞数目，通过不对称分裂维持干细胞数量及干性，同时产生分化的子细胞。干细胞分裂模式的异常往往导致许多临床疾病，特别是上皮组织疾病，包括肿瘤等。但是，目前对干细胞的对称和不对称分裂与这些疾病发生发展之间的作用机制知之甚少。因此，哺乳类干细胞分裂模式的研究对揭示上皮组织发育及病变的新机理和有效地防治相关疾病具有重要的科学指导意义。 干细胞分裂模式的调控涉及多方面的因素，尤其是细胞周期因子、miRNA、蛋白质修饰、特异信号转导系统等。这些因素不仅直接调控干细胞对称不对称分裂这一过程，而且与干细胞的功能有关。因此探讨这些因素之间的相互关系，并揭示它们如何调控干细胞干性维持，是干细胞研究的重要方向。 基于以上思路，我们一方面将利用哺乳类上皮干细胞、类器官体外培养体系和诱导多能干细胞体系，研究干细胞对称不对称分裂模式，细胞周期信号转导通路、细胞重编程过程、miRNA功能、蛋白质修饰和干细胞干性之间的相互作用机理；另一方面，利用直观、高效、快捷的果蝇和线虫遗传筛选体系以及这些模式动物先期工作中已经发现的一些调控干细胞分裂模式的重要因子，探索其在哺乳类干细胞干性维持中的同源功能及特异性，揭示调控干细胞分裂模式及干性维持的新机制，为临床应用提供新的理论依据。 总体思路图 (二) 技术途径 根据如上总体学术思路，设立本项目的总体研究技术途径。总体上，本项目将运用多种哺乳类上皮组织体外干细胞培养体系，研究干细胞分裂模式对干细胞干性维持的作用及其机制。以此为主轴，同时展开信号转导、细胞周期、细胞重编程、miRNA、蛋白质修饰、以及果蝇线虫模式动物的研究，多管齐下，系统地探讨干细胞对称不对称分裂和干细胞干性维持以及在细胞重编程中干细胞干性获得的机制。利用果蝇及线虫遗传学方法，筛选调控干细胞不对称分裂的新关键分子，研究它们在哺乳类上皮组织病变肿瘤发生发展过程中可能的作用机制。具体如下： 课题一利用独创的干细胞标记物分离纯化干细胞或特异的转基因荧光报告蛋白，在体外三维胶原蛋白培养体系、组织切片或活体胚胎中直观地、实时地追踪干细胞的分裂模式及分化过程。从特异信号转导系统这一角度，进行干细胞对称和不对称分裂如何影响哺乳类干细胞干性维持的机制研究。阐明在上皮组织再生修复及病理变化包括癌变过程中干细胞分裂模式和干细胞干性维持的作用及机理。        课题二利用实时荧光成像、荧光标记、基因芯片等技术，实时全方位地观测重编程过程的细胞周期变化与干性获得之间的关系，并明确这一过程中的细胞分裂模式；同时还为其他课题提供成熟的诱导多能干细胞技术平台，用于逆向验证分裂模式、细胞周期关键基因的功能。 课题三运用标记荧光蛋白实时示踪成像技术观察miRNA 302/367集群/let-7诱导多能干细胞分裂模式, 探讨miRNA与干细胞干性获得和维持的相关性。采用免疫沉淀Argonaute- RISCs-基因芯片技术鉴定miRNA 302/367集群/let-7特异的靶信号基因。利用HDAC1和HDAC2敲除小鼠细胞，阐明HDACs与干细胞干性获得和维持的分子机制。建立特异的miRNA启动子报告体系，研究其与已知信号通路分子、干细胞标记及转录因子的作用关系。利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析干细胞分化前后、对称/不对称分裂之间、及HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及其它蛋白质修饰，尤其是乙酰化的变化，为探明蛋白质修饰调控干细胞分裂模式提供依据。 课题四利用激光共聚焦显微镜，结合抗体制备和免疫荧光技术，观察参与不对称分裂的蛋白亚细胞定位。采用高分辨率活体显微成像技术，追踪GFP标记的相关蛋白在不对称分裂过程中的动态变化。通过二次亲和纯化技术和质谱分析，发现调控干细胞不对称分裂的新因子。利用果蝇和线虫遗传学手段（如RNAi、EMS诱变或P因子）发现调控干细胞不对称分裂的新基因。 (三) 创新与特色 目前对干细胞分裂模式的认识主要来自于果蝇和线虫，哺乳类干细胞分裂模式的调控机理非常复杂，许多方面尚属空白，有待于研究。本研究项目具有以下创新和特色： 1. 哺乳类上皮组织与肿瘤病变密切相关，研究哺乳类上皮，尤其是非脑组织上皮的干细胞分裂模式研究是一大创新。 2. 首次利用诱导多能干细胞系统逆向研究细胞周期、分裂模式相关因子与细胞干性获得之间的关系。 3. 利用干细胞标记物分离纯化干细胞，首次在体外三维上皮单位/类器官（organoid）的形成体系中直观地追踪干细胞的分裂模式及分化过程尚无报导。 4. 在活体示踪方面，将双光子、近红外等最新的荧光影像技术用于实时、无损地观察哺乳类上皮干细胞的对称与不对称分裂过程；并将最新的超高分辨影像技术（STORM）在亚细胞层面记录干细胞的对称与不对称分裂的精细变化。 5. 填补肿瘤的发生发展和干细胞的分裂模式之间的关系的研究空白。 6. 首次研究特异miRNA 302/367集群调控重编程过程中细胞分裂模式，阐明其在干细胞干性获得和维持中的分子机制。 7. 利用组蛋白去乙酰化酶（HDAC）敲除小鼠，首次研究抑制HDAC如何影响细胞分裂模式提高miRNA重编程效率的新机制。 8. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析HDACs敲除小鼠细胞组蛋白以及其它蛋白质修饰，尤其是乙酰化的变化。 9. 利用蛋白质组学技术和质谱技术系统分析干细胞分化前后组蛋白修饰的变化，为探明蛋白质修饰调控干细胞干性维持的机制提供依据。 10. 从果蝇和线虫中筛选新基因，对其进行蛋白定位和功能分析，并发现新的结合蛋白，研究其同源蛋白在哺乳类干细胞不对称分裂过程中的功能及调控机制。 11. 独创线虫胚胎后期高分辨显微成像技术，活体观察细胞不对称分裂，结合突变体分析，揭示干细胞不对称分化机制。 12. 首次整合果蝇、线虫和哺乳类各体系的优势，对干细胞对称/不对称分裂调控机制进行深入系统地研究。 （四）可行性分析 1. 理论上可行 近年来在干细胞干性维持和分裂模式研究方面, 特别是在模式动物果蝇和线虫干细胞分裂模式研究中取得了很大的进展，已经形成了初步的机理模型，为理解哺乳类干细胞分裂模式提供了理论框架和概念基础。国际上关于哺乳类上皮干细胞分裂模式的研究已经开始有相关报道，正在成为干细胞和发育生物学研究的热点。国内关于对称/不对称分裂模式对干细胞的干性维持的研究仍然处于起步阶段，本项目整合哺乳类、果蝇、线虫体系的各自优势，并结合在细胞周期、miRNA、蛋白质修饰、信号转导等方面研究的先进技术，为在干细胞干性维持和分裂模式研究领域取得重大突破奠定基础。 2. 课题组能力和条件可行 本项目的科研队伍以从事干细胞科学、发育生物学、遗传学、细胞生物学、生物影像学、分子生物学研究的“985工程”国家重点大学和中国科学院为主体，集中了目前上海、浙江、广东、北京、四川地区从事干细胞研究的优势科研团队。其中，课题负责人高维强教授和重要骨干杨小杭教授为国家中央组织部“千人计划”入选专家。其他课题组组长和主要骨干成