干细胞培养.doc

脐带血干细胞的制备与分离流程 脐带血干细胞的制备采集流程：现阶段采集和制备脐带血干细胞通常采取密闭式收集法，这种方法操作简单实用，采集到的脐血受污染的几率小。采集是在孕妇分娩新生儿出生后，立刻进行采集工作，在胎盘还没有分娩出时操作完成，全部过程用时不能超过分娩后五分钟。采集脐血在距离新生儿脐部五至七厘米处，事先准备两把止血钳，两端夹住脐带目标部位后剪断，包扎处理新生儿脐带后，用采血袋针穿刺胎盘侧脐带较粗静脉，脐血会伴随子宫的收缩而缓缓流入采血袋内，采集过程中轻摇采血袋；在胎盘剥离前轻轻按压宫底，当胎盘完全分娩出后轻轻按压胎盘和脐带已使残留的脐血流入袋中，增加脐血采集量，直到不再流出时为止。将每个胎盘采集来的脐血作为一个单位包装，每份脐血容量在60毫升~120毫升之间。 脐带血干细胞的分离： 1.观察脐带血的状态。如果血中出现凝血块，可以选择使用一次性无菌输血器进行过滤然后在进行干细胞的分离等操作。 2.制备样本。准备5毫升注射器吸取1毫升血液作为血液样本用于检测细胞存活率、血型以及进行细胞计数。 3.脐血中添加HES（乙基淀粉）。脐血与HES的比例为5:1，可以使用五十毫升注射器精准添加所需要的HES。 4.倒置离心。设定所需离心条件50g、10℃、7min。 5.收集富白细胞血浆，除去多余红细胞。 6.正置离心。设定所需离心条件747g、10℃、15min。 7.将转移带在离心结束后从离心杯中取出，放在分浆夹中提取19毫升血浆(用于病毒检测和细菌培养)用五十毫升注射器提取三十毫升血浆用于留样。 8.将转移带内的脐带血充分混合均匀后，使用5毫升注射器提取0.8毫升的脐带血作为样本，其中0.5毫升用作细胞计数和CD34阳性细胞检测，剩余0.3毫升用作干细胞的培养检测。 1. 无菌条件下从新生儿脐带中获得脐血。 2. 有核细胞分离：将脐血混匀后转移到250ml滴瓶内，加入1/4量的6%羟乙基淀粉氯化钠注射液，充分混匀后悬挂于超净台内，放置45min。 3. 吸取上层富含有核细胞悬液3ml，于4℃、1000r/min离心8min，去上清液后重新用5mlIMDM培养基悬浮细胞，1000r/min离心洗涤2次，并用含20% FCS的IMDM培养液调整细胞密度为1×109个/L供细胞集落培养用。 4. 半固体集落培养：红细胞集落形成单位（CFU-E）的培养用Metho Cult TMH4330培养基，0.9ml培养基加入0.1ml的细胞悬液，充分混匀后转移至35mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本重复3孔，适时观察。于第7天计数CFU-E。粒细胞单细胞系集落形成单位（CFU-GM）的培养，培养基为Methocult TMGF+ H4330，1ml培养基加入0.1ml细胞悬液，充分混匀后转移至35mm的6孔培养板，于37℃、5% CO2培养箱培养，每个标本重复3孔，适时观察。14天计数CFU-GM集落数。 结果及鉴定： 红系集落培养第2天就可以观察到细胞分裂，第3天时可形成较小的细胞簇，4-6 d有50个以上细胞组成的致密型集落，显微镜下可以看到呈淡红色已经血红蛋白化的红系集落，以后集落体积增大。第8天时肉眼可见红色的红系集落，9-11 d达高峰，以后只是集落的体积增大，集落数并没有增多。脐血7d的CFU-E（>8个细胞）平均为（104+/-48）个/105有核细胞，CFU-GM集落培养在第5天开始有集落形成，以后逐渐增多，8-11d达高峰，此后集落不断增大，总的集落数并不增加。CFU-GM平均为（119+/-65）个/105有核细胞。 经联苯胺染色的红系细胞胞质呈橘红色，胞核呈紫色；只培养2d的粒细胞还未形成集落，胞质不呈橘红色，核形式多样。 细胞培养的冻存方法： 常规胰酶消化，离心，去上清，加冻存液（5%DMEM或甘油+95%FCS），4℃ 10min，-20℃ 30min，-80℃过夜，转入液氮。