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猪病诊断技术规范 一、致病性大肠杆菌的检测 1 引用标准 参考NY/T 555-2002（动物产品大肠杆菌、粪大肠菌群和大肠杆菌的检测方法）。 2 范围 适用于猪大肠杆菌病的诊断。 3 检测方法 3.1 材料 3.1.1 营养肉汤 3.1.2 营养琼脂 3.1.3 EMB 3.1.4 TSI 3.1.5 IMViC生化鉴定管 3.1.6 小白鼠 3.2 分离培养 a) 将采集的肝、脾、心血或肠内容物等分别接种伊红美兰琼脂平板（同时接种营养肉汤增菌备用），置37 ℃培养18~24 h。 b) 观察培养特性，挑取黑色有金属光泽的菌落，用该菌落涂片，革兰氏染色，镜检。 c) 如可见到两端钝圆并多以单个存在的革兰氏阴性粗短杆菌，应取5~10个典型菌落再接种于TSI琼脂。 d) 同时挑取典型菌落接种营养琼脂，37 ℃培养16~18 h的菌液用于生化特性鉴定。 3.3 生化鉴定 挑取上述菌落纯培养物接种以下生化培养基和乳糖发酵管，(36±1) ℃培养24 h后观察结果。 3.3.1 靛基质试验： a) 滴加Kovacs氏靛基质试剂0.1 mL于靛基质试验培养基中混合，观察结果。 b) 出现红色环的为反应阳性；出现黄色环的为反应阴性。 3.3.2 甲基红（MR）试验 a) 滴加甲基红指示剂0.2 mL于MR-VP培养基中混合，观察结果。 b) 出现红色为阳性反应；出现黄色为阴性反应。 3.3.3 VP试验 a) 滴加VP试剂甲液0.2 mL于MR-VP培养基中混匀，再滴加VP试剂乙液0.1 mL混匀，静置，观察结果。 b) 在15 min内出现红色的为阳性反应；无颜色变化的为阴性反应。阴性结果1 h后再观察一次，出现红色也为阳性反应。 3.3.4 枸橼酸盐试验：观察培养基颜色变化，出现蓝色为阳性反应；不变色为阴性反应。 3.4 大肠杆菌鉴定结果 应符合表1要求。 表1 大肠杆菌鉴定结果 靛基质 MR VP 枸橼酸盐 鉴定 + + - - 典型大肠埃希氏杆菌 - + - - 非典型大肠埃希氏杆菌 + + - + 典型柠檬酸盐杆菌 - + - + 非典型柠檬酸盐杆菌 - - - + 典型产气杆菌 + - - + 非典型产气杆菌 出现表1的生化反应类型时，如果为组织样品，由此可初步报告为致病性大肠杆菌。如果为粪便，尿液，饲料，饮水，应进一步做致病性试验。 3.4 致病性试验 a) 取经营养肉汤37 ℃培养16~18 h后的纯化菌株培养液，分别腹腔接种体重20g左右的小白鼠，每株接种2~3只，每只0.3 mL（含菌量约为1×1012 cfu／mL），同时用相同数量的小白鼠接种无菌肉汤作对照。 b) 饲养观察、记录死亡数，并从死亡鼠的心、肝中回收接种菌。在24小时内出现死亡的可报告为致病性大肠杆菌。 4 药敏试验 a) 挑选琼脂平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，37 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。 b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109 cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置37 ℃培养24 ｈ后观察。 c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。 二、沙门氏菌的检测 1 引用标准 参考NY/T 550-2002（动物和动物产品沙门氏菌检测方法）。 2 范围 适用于猪沙门氏菌病的诊断。 3 检测方法 3.1 材料 3.1.1 SC 3.1.2 DHL 3.1.3 TSI 3.1.4 赖氨酸脱羧酶（LD） 3.1.5 邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷（DNPG） 3.1.6 甘露醇糖发酵管 3.2分离培养 a) 采集疑似病例的肝、脾、心血或肠内容物样品。 b) 无菌剪取肝、脾样品1 g，投入10 mL SC增菌液中（血液、粪便样品可以采适量直接投入10 mL增菌液），36±1 ℃培养18~24 h。 c) 取一接种环增菌液划线接种于DHL琼脂平板上，36±1 ℃培养18~24 h。观察平板上菌落生长形态。沙门氏菌在DHL平板上呈无色半透明，产硫化氢（H2S），菌落中心黑色或几乎全黑色。 3.3 生化鉴定 a) 挑取DHL平板上可疑菌落3~5个，每个菌落先洗入TSI培养基冷凝水中，继而在斜面上划线接种并高层穿刺接种。 b) 再挑取同一菌落依次接种氨基酸脱羧酶发酵试验（LD）和ONPG，甘露醇糖发酵管三支生化管，若菌落偏小，二次挑取菌落有困难，可用接种环醮取TSI培养基中冷凝水接种其余生化管，36±1 ℃培养18~24 h（挑取菌落后的平板，应置于4 ℃冰箱保留48 h以备复查）。 c) 按表1记录反应结果，对照表2进行判定。 d) 凡符合表2生化反应模式，可报告为沙门氏菌。 表1 生化反应结果判定 生化管 TSI LD ONPG MAN 底a 斜面b 硫化氢 第一次颜色 记录符合 黄 + 黄 + 黑 + 紫 + 深黄 + 黄 + 第二次颜色 记录符号 红 - 红 - 无黑色 - 黄 - 无色或淡黄 - 紫 - a “底”观察葡萄糖反应。 b “斜面”观察乳糖和蔗糖反应。 表2 生化检测沙门氏菌属判定表 序 号 TSI LD ONPG MAN 判定 底 斜面 硫化氢 A Ba C Db Ec Fd G + + + + + + - - + - - - - +- + + + + - - - + + + - + - +- - + + - - - + + + + + + + +- 沙门氏菌亚种Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 沙门氏菌亚种Ⅲb、15％Ⅲa 沙门氏菌亚种Ⅲa、Ⅴ、15％Ⅲb、15％Ⅱ 少数沙门氏菌亚种Ⅰ 少数沙门氏菌亚种Ⅰ 甲型副伤寒沙门氏菌 非沙门氏菌 a含1％硫化氢阳性的大肠埃希氏菌，可加试靛基质加以鉴别，其中大肠杆菌阳性，沙门氏菌阴性。 b赖氨酸阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱沙门氏菌孔成道夫变种、鸡等。 c 硫化氢阴性的沙门氏菌主要有：甲型副伤寒、伤寒、猪霍乱、猪伤寒、仙台、贝塔、巴布亚、鸡、马流产、山夫登堡、都柏林登。。 d可直接用（O）单因子血清证实，以排除雷极氏普罗菲登斯菌登。 4 药敏试验 a) 挑选DHL平板上典型菌落接种营养肉汤培养中，36±1 ℃培养16~18 h，菌液用于药敏试验。 b) 将肉汤培养物（用标准比浊管比较达相同浊度）稀释至含菌量为1×109 cfu／mL，摇匀后蘸取菌悬液均匀涂布于琼脂平板上，然后用无菌镊子将药敏片贴附其上，每纸片2~5张，置36±1 ℃培养24 ｈ后观察。 c) 根据抑菌圈大小来判定其对药物的耐受性，选择敏感药物。 三、产气荚膜梭菌的检测 1 引用标准 自定标准。 2 范围 适用于猪产气荚膜梭菌病的诊断。 3 材料 3.1 绵羊血琼脂 3.2 牛乳培养基。 4 组织染色镜检 对疑似病例的肠道黏膜涂片，魏氏梭菌呈G+，直杆状，两端钝圆，单在或成双，无鞭毛，不运动。芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，多数菌株可形成荚膜。 5 分离培养 可将肠道内容物接种血平板，37 ℃厌氧培养18～24 h后观察。菌落特点：魏氏梭菌在血平板上可形成直径2～5 mm、圆形、边缘整齐、灰色至灰黄色、表面光滑半透明、圆屋顶状菌落，有双层溶血环。可通过镜检对形态进一步确定。 6 生化鉴定 对牛乳培养基的“暴烈发酵”。 7 肠内毒素检查 采集空肠后段或结肠前段内容物，加适量生理盐水稀释，经离心沉淀后取上清液分成两份，一份加热（60 ℃ 30min）。两份上清液分别静脉注射家兔（1～3ml）或小鼠（0.1～0.3ml）。如有毒素存在，不加热组动物常于数分钟至数小时内死亡，而加热组动物不死亡。 8 报告 因为正常人畜肠道内存在此菌，并且发病菌主要靠在肠道内产生毒素致病，细菌本身并不侵入机体。因此只有细菌分离和肠毒素检查都符合，并结合临床症状才能报告产气荚膜梭菌感染。鉴别A型和C型要靠中和保护试验。 四、猪痢疾诊断 1 引用标准 参考NY/T 545-2002。 2 范围 适用于猪痢疾（SD）的实验室诊断。 3 粪便中Sh显微镜检查 3.1 材料 3.1.1 器材：显微镜，暗视野镜头，玻片及盖玻片，酒精灯等 3.1.2 染色液：结晶紫染色液或稀释的石炭酸复红。 3.1.3 样品：病猪新鲜粪便（含粘）或直肠拭子或大肠内容物及黏膜 3.2 操作方法 3.2.1 染色样品制作：取样品直接抹片，干燥，火焰固定，以1.2.2结晶紫液或稀释复红染色2 min~3 min，水洗，吸干后待检。 3.2.3 悬滴样品制作：取样品少许悬于生理盐水，待检。 每份样品最少制片2张 3.2.4 显微镜检查：染色样品以油镜直接观察，悬滴样品在暗视野400~1000倍镜头下观察。 3.3 结果判定 典型Sh菌体长6 μm~8.5 μm，呈2~5个密螺旋体，两端尖锐，呈蛇样活泼运动。当视野中有数量（3~5条以上）Sh样菌体时，在获培养前，可作为诊断的重要参考。 4 分离培养和鉴定 4.1 材料准备 4.1.1 器材：厌氧培养装置及使用方法，细菌学实验常规器材，外科手术器材，微孔滤器和0.65 μm滤膜。 4.1.2 试验动物：小鼠（20 g左右） 4.1.3 试剂：PBS(0.01M，pH7.2)，生理盐水，多粘菌素，TSA。 4.1.4 样品：病猪新鲜粪便或大肠粘膜刮取物（含粘液）。对死猪或扑杀猪大肠分段结扎（每段10cm），分离取出。样品应尽早分离培养，也可0～4 ℃保存4～7 d。 4.2 操作方法 4.2.1 样品种Sh镜检 将样品少许摸片染色或作成悬滴标本，镜检，观察Sh有无活力。含菌量少且无活力者，则难以分离成功。 4.2.2 分离培养 4.2.2.1 直接划线分离法：即取样品直接在TSA上划线接种若干皿。 4.2.2.2 集菌法：先将样品以生理盐水或PBS作1：5稀释，2000 r/min，弃去沉淀。将上清液再以6000～8000 r/min离心20 min。取沉淀划线接种TSA若干皿。 4.2.2.3 稀释法：将样品或集菌法的沉淀物作10倍梯度稀释至10-6～10-8。取各梯度稀释液各1滴，分别划线接种于TSA上，（每梯度稀释液最少接种3皿）。接种后的培养皿置厌氧罐内进行厌氧培养。若上述稀释液中加入多粘菌素200 U/mL～300 U/mL，可提高分离率。 4.3 结果判定 4.3.1 观察 每隔2～4 d开罐检查一次，共2～4次，观察有无溶血区及溶血菌落。 致病性Sh呈强β溶血，一般看不见菌落。当培养条件适宜时，再溶血区可见到云雾状菌苔。无害蛇样螺旋体等呈弱β溶血。 4.3.2 移植纯化 先作溶血区内物质涂片，染色镜检。如见Sh样菌体，可在无菌落溶血区内移取小块琼脂划线于TSA若干皿。如此每隔2天移植一次，一般2~4次后即可纯化和保存。 4.3.3猪蛇样螺旋体鉴定 4.3.3.1 溶血试验 将猪蛇样螺旋体、无害蛇样螺旋体或毛肠蛇样螺旋体及被检菌株，分别划线于同一TSA上不同区内，经48 h培养后，观察比较其溶血程度。 4.3.3.2 肠致病性试验 每菌株至少接种6只小鼠，将小鼠停饲24 h后，每只每次灌服1 mL（含菌3～5亿），次日再灌服一次，15 d后剖检观察盲肠病变。感染后50％出现腹泻和病变者，则为致病性Sh。 五、猪巴氏杆菌病诊断技术 1 引用标准 参考NY/T 564-2002。 2 范围 适用于猪巴氏