干细胞成骨、成脂、成软骨诱导分化及检测.doc

三个方向诱导分化 诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化 一、诱导方法 将细胞悬液置于 50 mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导MSCs 向软骨细胞转化的诱导因子: (一致统一的诱导物质) 转化生长因子β1 10ng/ml, （左旋）维生素 C 50 mg/L(也有0.1mmol/L) 地塞米松 0.1nmol/L （也有10 nmol/L） ITS 50mg/ml 丙酮酸钠 1mmol/L 亚油酸 5.35ug/mg 牛血清白蛋白 1.25ng/ml。 倒置显微镜逐日（1－3 weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。 细胞培养3周。去除培养液,晾干, ①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司) 免疫组化，按试剂盒说明书操作； ②用alcian blue 孵育5 min, 流水冲洗2 min , 麦氏苏木素复染5 min ,流水冲洗2 min ,晾干， 显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。 或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的： MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测： 培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液， 10％甲醛固定lh， 自来水冲洗15min， 双蒸水冲洗1次， 滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h， 加人95％乙醇，洗去多余的染液， 烘干，中性树胶封片。 诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化 成骨诱导培养: 取第 3代细胞, 接种入含体积分数为 0.1 的新生牛血清 、 0.1 μmol/L 地 塞 米 松 、 50 μmol/L 抗 坏 血酸 、 10 mmol/L β- 甘 油 磷 酸 钠 的 高 糖 DMEM培养基进行成骨诱导培养, 进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测: ①碱性磷酸酶组织化学染色: 取成骨诱导 14 d 的细 胞 , 40 g/L 中 性 甲 醛 固 定 15 min, Gomori改良钙钴法染色。取 5 块玻片, 每片随机取 2个视野, 采用网格计数法, 计算碱性磷酸酶染色 阳性细胞的百分比。 ②碱性磷酸酶活性检测: 取第 3 代细胞, 以 1×105/ 孔的密度接种于6 孔板中, 分别成骨诱导 3, 5, 7, 10, 12, 14 d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。 ③钙结节染色: Von Kossa’s矿化结节染色法 原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。 Van kossa银染色法 试剂： 1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100 ml。 2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100 ml。 培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次 2. 2%硝酸银内置暗处1小时 3. 蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟 4. 还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml） 5. 5%硫代硫酸钠1小时 1.固定后的细胞爬片用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2遍； 2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min，日光或紫外光曝晒10－45 min，蒸馏水洗涤； 3.浸入5%次亚硫酸钠（3%硫代硫酸钠冲洗）溶液中，蒸馏水洗； 4.1%中性红衬染1 min，水洗，晾干，酒精系列脱水（常规顺序：80％－90％－95％－100％1－100％2），二甲苯透明，中性树胶封片。 l 1. Sections to water. 切片脱蜡至水   2. Place sections in 1% silver nitrate solution under ultra- violet light for 45 minutes. 置于1％硝酸银溶液在紫外光下45分钟 3. Wash in distilled water. 蒸馏水漂洗 4. Treat with 3% sodium thiosulphate for 5 minutes. 3％硫代硫酸钠处理5分钟 5. Wash in water. 用水漂洗 6. Counterstain with van Gieson for 5 minutes. Van Gieson复染5分钟 7. Wash in alcohol. 乙醇漂洗 8. Clear . Mount sections in DPX 透明封片 结果：钙盐沉积区域呈黑色，背景红色. A 组以现行报道方法染色:4 %多聚甲醛固定标本 , 1 %硝酸银溶液紫外线下染色 10min , 用 5 %硫代硫酸钠染色 2min , 1 %中性红复染 10min , 酒精冲洗后观察。 B 组以改进的方法染色: 4 %多聚甲醛固定标本 , 5 %硫代硫酸钠孵育 30min ,蒸馏水冲洗 ,然后用1 %硝酸银溶液紫外线下染色 30min , 蒸馏水冲洗掉浮于细胞表面的黑色物质 , 继续用 5 %硫代硫酸钠染色 2min , 1 %中性红复染 10min ,蒸馏水漂洗后观察。 或取成骨诱导 21 d 的细胞, 体积分数为 0.95 的乙醇固定 15 min, 10 g/L 茜素红 S 染液在室温下浸染 10 min, 去离子水洗涤3次, 倒置显微镜下观察。 二、茜素红染色 茜素红S 中文名称: 茜素红S英文名称:alizarin red S; sodium alizarin sulfonate CAS: 130-22-3分子式: C14H7NaO7•H2O分子量: 360.28中文别名: 9,10-二氢-3,4-二羟基-9,10-二氧代-2-蒽磺酸单钠盐； 茜素红；（3） 茜素磺酸钠 ；茜素S ；酸性媒介茜素红；酸性媒介红S-80（Acid Mordnat Reds-80）；C. I.媒介红3（C. I. Mordant Red 3）。 性质：橙黄色的针状体。溶于水，微溶于醇，不溶于氯仿和苯。1%水溶液pH2.15。由茜素经发烟硫酸磺化，然后转变为钠盐制得。茜素红能和许多金属离子生成稳定的红色络色物，在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；在分析中常用作金属指示剂；光度法测定金属离子的显色剂；酸碱指示剂，第一变色范围PH值3.7(黄)～5.2(紫)，第二变色范围PH值10.1(紫)～12.0(浅黄)；用于极谱法测定金属离子。 用途: 络合滴定指示剂和酸碱指示剂。 配制：将托盘天平上称取0.1g茜素磺酸钠定溶于100ml蒸馏水中转移入滴瓶中，贴标签备用。 或用茜素红粉加PBS溶解后，要注意调节PH值到7.2！过滤就可以了。0.1%的茜素红Tris-HCL(PH8.3), Tris的浓度做分子生物学一样的，用0.1mol／L的HCI或0.1％的NaOH调节。 茜素红染液配方 配方一 茜素红染液（Ⅰ） 取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和溶液。 配方二 茜素红溶液（Ⅱ） 取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素红染液 ?茜素红(Fluka)溶于96％乙醇中配成0.12％的茜素红液。 配方三 0.1%的茜素红配Tris-HCL(PH8.0) 具体配制方法――1g Tris（1g左右Tris均可）加入三蒸水100ml中，用滴管往配制液中加HCl（分析醇），一滴滴地加，边加边测试PH，待PH为8.3左右即可（无精密PH测试仪，用PH试纸也是一样的，但是要能测到8点几的PH试纸），配好后往里面加0.1g的茜素红，便得到0.1%茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)溶液。 茜素红染色步骤 1、弃培养基，培养皿用PBS冲洗2次， 2、95% (也有90％)乙醇固定10－30min，蒸馏水冲洗3次 3、 0.2% （or 0.1%）茜素红[茜素红－Tris-Hcl(PH 8.3)]染色,37℃,30min ,用清水冲洗。 在低倍镜视野(4 ×10) 下进行矿化结节计数 钙染色法—茜素红法 染色步骤 1． 茜素红S染液5分钟 2． 用丙酮洗20分钟 3． 丙酮：二甲苯（1：1）溶液20秒 4. 树胶封固 结果：钙累及物呈桔红色 ④Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色（成骨特有） 取成骨诱导 7 d 的细胞爬片,磷酸盐缓冲液漂洗, 4 ℃ 丙酮固定 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液 洗 3 次 , 5 min/ 次 ; 体 积 分 数 为0.03 的过氧化氢孵育 10 min, 磷酸 盐 缓 冲 液洗 3 次, 5 min/ 次; 血清封闭液封闭 15 min, 倾去封闭液, 磷酸盐缓冲液稀释的Ⅰ型胶原Ⅰ抗 4 ℃ 过夜, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次;兔抗羊Ⅱ抗室温 1 h, 磷酸盐缓冲液洗 3 次,5 min/ 次; 辣根酶标记的链霉素卵白素工作液室温 15 min, 磷酸盐缓冲液洗 3 次, 5 min/ 次,二氨基联苯胺显色, 自来水冲洗、复染、脱水、透明、封固。 诱导脂肪方向分化 诱导分化 细胞以每毫升 5 ×104 ,接种于培养皿中 ,细胞达到 80 %汇合后更换成脂诱导培养液(L－DMEM 培养液 ,10 % FBS , 地塞米松 10-6mol/L , 胰岛素10 mg/L , 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX 0.5 mmol/L ,吲哚美辛 0.2mmol/L),对照组继续加常规培养液 ,每 3 天换液一次。在诱导 6 、9 、12 、15 、18 d 时各取各组细胞进行油红 O 染色 ,光镜下观察并摄影。 油红O配方 油红O1g,异丙醇100ml或70%酒精100 ml,将油红O放入烧瓶于水浴中加温溶解或放入温箱中60℃30min,用前过滤,临用时取油红O10ml,蒸馏水10ml,两者混合后立即变成鲜红色液体,静止30mi n后过滤使用. 油红O染色 ①固定于10%中性甲醛溶液内1～2d. ②蒸馏水洗冰冻切片1 0～20μm入蒸馏水. ③用70～80%异丙醇或酒精稍洗或用蒸馏水稍洗. ④入油红O 染色15～25min. ⑤入异丙醇或酒精或蒸馏水洗. ⑥用苏木素淡染细胞核,充分水洗,用甘油明胶或用PVP封固.