三个方向诱导分化诱导骨髓间充质干细胞成软骨分化一、诱导方法将细胞悬液置于50mL聚苯乙烯培养瓶(Nunclon)中培养。完全培养基中加入能诱导MSCs向软骨细胞转化的诱导因子:(一致统一的诱导物质)转化生长因子β110ng/ml,（左旋）维生素C50mg/L(也有0.1mmol/L)地塞米松0.1nmol/L（也有10nmol/L）ITS50mg/ml丙酮酸钠1mmol/L亚油酸5.35ug/mg牛血清白蛋白1.25ng/ml。倒置显微镜逐日（1－3weeks）观察细胞生长情况。细胞长成单层后进行传代。细胞培养3周。去除培养液,晾干,①细胞用通用Ⅱ型胶原检测试剂盒(晶美生物工程有限公司)免疫组化，按试剂盒说明书操作；②用alcianblue孵育5min,流水冲洗2min,麦氏苏木素复染5min,流水冲洗2min,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。或者用甲苯胺蓝染色，具体我也没做过，查到一篇文章中是这么说的：MSC成软骨诱导后的甲苯胺蓝染色检测：培养不同时间的MSC培养皿倒掉诱导培养液，10％甲醛固定lh，自来水冲洗15min，双蒸水冲洗1次，滴加1％甲苯胺蓝染液于培养皿内，染色3h，加人95％乙醇，洗去多余的染液，烘干，中性树胶封片。诱导骨髓间充质干细胞成骨方向分化成骨诱导培养:取第3代细胞,接种入含体积分数为0.1的新生牛血清、0.1μmol/L地塞米松、50μmol/L抗坏血酸、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基进行成骨诱导培养,进行形态观察、功能检测。间充质干细胞成骨特性检测:①碱性磷酸酶组织化学染色:取成骨诱导14d的细胞,40g/L中性甲醛固定15min,Gomori改良钙钴法染色。取5块玻片,每片随机取2个视野,采用网格计数法,计算碱性磷酸酶染色阳性细胞的百分比。②碱性磷酸酶活性检测:取第3代细胞,以1×105/孔的密度接种于6孔板中,分别成骨诱导3,5,7,10,12,14d,按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测。③钙结节染色:VonKossa’s矿化结节染色法原理是将矿化基质中的磷酸盐(钙)、碳酸盐(钙)转变为磷酸银、碳酸银，然后用日光、紫外线或强还原剂使其还原为黑色的金属银。本试验染色过程中未作细胞衬染。Vankossa银染色法试剂：1．2%硝酸银水溶液：硝酸银2g蒸馏水加至100ml。2．5%硫代硫酸钠水溶液：硫代硫酸钠5g，蒸馏水加至100ml。培养皿用PBS冲2次，95%乙醇固定10分钟，蒸馏水冲洗3次2.2%硝酸银内置暗处1小时3.蒸馏水冲洗3次，再流水冲洗10分钟4.还原1小时（硫代硫酸钠5g，氢氧化钠0.2ml，蒸馏水100ml）5.5%硫代硫酸钠1小时1.固定后的细胞爬片用0.01mol/LPBS(pH7.4)洗涤2遍；2.浸入5%（也有1％）硝酸银水溶液中10min...
