干细胞标记论文.doc

SPIO标记人胚胎干细胞皮下注射小鼠的示踪研究 【摘要】目的：探讨超顺磁性氧化铁微粒（SPIO）体外标记人胚胎干细胞（ESC）及体内示踪皮下注射裸鼠的人胚胎干细胞的能力。方法：使用硫酸鱼精蛋白-SPIO 共培养方式标记人胚胎干细胞。采用显微镜观察干细胞标记情况，并进行富集纯化，将经过SPIO标记的干细胞皮下注射裸鼠体内，应用1．5TMRI系统进行磁标记干细胞成像。结果：初步标记后的人胚胎干细胞用显微镜观察，SPIO标记的干细胞细胞胞质内出现细小的黑色铁颗粒，标记效率为90％；标记了SPIO 的人胚胎干细胞体内MRI 成像时显示，细胞移植区域T2信号减弱。结论：SPIO能成功地标记ESC，SPIO 标记的ESC 皮下注射入小鼠体内的分布、迁移过程可用MRI进行检测评价。 【关键词】干细胞移植；示踪；超顺磁性氧化铁；磁共振成像；标记 近些年来，胚胎干细胞的研究一直是生物医学工程学中的热点。胚胎干(embryonic stem,ES)细胞因具有全能性和无限增殖的能力而有望成为组织工程中种子细胞的新来源[1]。但是, ESC目前尚不能真正应用于临床治疗, 还有许多问题亟待解决。其中, 较为突出的是如何对移植的干细胞进行长期的、无创伤的实时检测, 从而了解其在体内的分布、迁徙、分化和转归等生物学行为。本实验用SPIO标记人的胚胎干细胞，并通过皮下注射小鼠体，用MRI检测其增殖分化特性。 核磁共振成像( MagneticResonance Imaging，MRI)是分子影像学的一种技术，增加了本实验过程细胞移植的无创活体示踪的可行性。根据成像方法不同， 分子成像主要包括核素分子成像、磁共振( magnetic resonance, MR )分子成像、光学分子成像等。因MR成像具有无放射性, 有较高的软组织分辨能力和良好的重复性而倍受推崇[2]。 超顺磁性氧化铁微粒( superparamgnetic iron oxides，SPIO)为一种纳米分子探针，具有因良好的生物相容性和磁共振信号敏感性而被应用于该实验中。细胞通过吞噬、吞饮等方式将纳米粒子内吞于细胞体内，而对不具有吞噬能力或吞噬能力较弱的细胞, 由于标记率低而不能直接将此类造影剂用于细胞的标记。磁性纳米粒子表面修饰被认为是磁性纳米粒子与细胞膜表面非特异性相互作用的关键因素, 影响细胞标记率[1]，并且磁性粒子的粒径影响磁共振灵敏度， 磁性纳米簇与单个纳米粒子相比能显著增强MRI信号[2-4]。本研究选择微米级超顺磁氧化铁颗粒(SPIO)标记小鼠胚胎干细胞(ESC)及其分化的心肌细胞并行MR显像，以检测标记的有效性和对细胞生物学活性影响。 1 材料与方法 1．1 材料 裸鼠、 硫酸鱼精蛋白、SPIO、1．5TMRI 1．2 方法 1．2．1 混合液的配制 1.先称取10mg的硫酸鱼精蛋白溶于10ml的蒸馏水中； 2.用枪吸取0.3ml的SPIO溶于20ml的无血清的培养基中； 3.取1中已配制的溶液100ul加入2中溶液中，使硫酸鱼精蛋白浓度为5ug/ml； 4.往3中的溶液加入等体积的双倍血清培养基，使最终SPIO的浓度为50ug Fe/ml,即所需溶液。 1．2．2 干细胞的体外标记及富集 6天之后，两种细胞长到大约整个瓶壁的60%，即用我们预先配制好的混合液给细胞换液，孵育过夜，接下第二天，观察磁珠标记的情况，并拍照，大多数细胞均被标记。为了得到更高的标记效率，第三天我们又进行了富集纯化，富集过程如下： 1.用胰酶消化细胞，加入3ml的培养基，并将细胞转移到15ml的玻璃离心 中，15000rpm离心5min，弃上清； 2.加入新的培养基打匀细胞，用强力磁石富集，弃上清，重复2次； 3.加入2.5ml新培养基打匀之后转移至小培养皿中，4小时之后细胞贴壁之后观察，并进行拍照，观察富集情况，对比富集前后的磁珠标记的情况，富集后几乎每个细胞均被标记。 1.2.3 收集标记的细胞，制成100ul悬液，皮下注射小鼠左腋下，2周后进行核磁共振成像 2 结果 2．1 SPIO 标记干细胞的结果 干细胞的超顺磁氧化铁颗粒标记：电镜显示ESC胞质内散在分布许多囊泡样结构即吞饮小泡，高密度铁颗粒主要集中在囊泡内，直径大约0．8～1．5 m(图1)。镜检可见ESC胞浆内存在大量黑色的SPIO 颗粒，细胞标记率为90％（图1） 富集前检测SPIO标记ESC（200*） 富集后检测SPIO标记ESC（100*） 图1 2．2 MRI 检测 经SPIO标记的ESC移植入正常小鼠左腋皮下，于3-6周后行MRI扫描，在移植部位可见信号缺失区（图2）。 细胞移植后的小鼠腋下MRI 扫描结果 图2 3 讨论 1，鱼精蛋白-SPIO标记率 单独使用SPIO标记非吞噬细胞的效果差，而SPIO和阳离子转染剂(transfection agents，Tas)形成混合物与细胞共培养可大幅提高细胞内的铁摄入量[3-4]。细胞标记效率与细胞种类、SPIO与转染剂的种类及浓度、共培养时间等有关[3]，因此不同种类细胞的最佳化标记方案需要大量实验验证，而每种细胞对应标记策略的安全性检测至关重要。虽然大多数研究显示在适当剂量内SPIO标记不会影响干细胞的活性、增殖、分化及增加细胞凋亡[3-5]，但有研究表明较高浓度的SPIO会限制干细胞的增殖[5]，磁标记干细胞剂量依赖性的向成骨及成软骨分化减弱亦见报道[5-6]。 由于细胞膜及一般未修饰的SPIO都带负电荷，细胞不容易摄取，葡聚糖、去铁蛋白、羧酸聚酰胺树脂等包被材料，以及PLL、磁性脂质体、植物血凝素等转染介质的应用大大增加了其被细胞吞噬的效率[7]。对氧化铁的修饰不仅要增加氧化铁同细胞膜的亲和力,还要进一步帮助氧化铁微粒进入细胞质内。本次实验用硫酸鱼精蛋白作为转染介质能穿梭于细胞膜内外。 Emerit等[8]研究发现:细胞内非结合的铁能使氧化作用加强,形成过多的氧化产物和羟基自由基而损伤细胞,甚至导致细胞坏死。然而,目前国内外文献关于铁浓度对标记细胞的影响的报道差异较大,可能是由于所用的氧化铁微粒不同而引起的细胞内实际游离铁的差异、标记细胞的浓度差异以及标记时间长短不一引起的。但是, 由于细胞磁标记随着铁浓度和孵育时间的增加而增加[9] , 且逐渐增加铁标记浓度和延长标记时间将对细胞的活性及增值能力产生负面影响[ 10] , 用于磁化标记的铁浓度应当选择在满足要求的较低浓度, 我们提倡在共同孵育24 h情况下, 铁浓度应选择在20~40 Lg/ml。 2.MRI成像 随着分子影像学的发展，活体追踪干细胞成为可能。MRI示踪术是一种示踪细胞迁移的有效方法。然而，常规MRI无法显示移植细胞和与细胞作用的靶细胞或靶器官。而使用超顺磁性氧化铁SPIO作为负性标记物则可以解决此难题。SPIO 在临床中主要用于肝脏的MRI 负性增强成像，近年来发展到各种细胞的成像，如干细胞［11，12］。在用于细胞标记时，标记细胞内的SPIO 在磁场中引起局部磁场紊乱，在标记了SPIO 的细胞部位及其周围一定空间范围内产生无信号或低信号区， 从而判断被标记细胞的位置， 根据其位置的改变和信号的衰减还可判断细胞的移行、空间分布和增殖情况。细胞膜与SPIO 颗粒都带有负电荷，两者相互排斥使得氧化铁颗粒很难进入细胞内，标记率低，所以必需对氧化铁颗粒进行适当的修饰，改变其粒子的电性。本实验采用鱼精蛋白包埋SPIO颗粒，使带负电荷的细胞膜通过非特异性吸收过程摄取SPIO 颗粒。结果显示鱼精蛋白能使SPIO 高效地标记ESC。在显微镜下观察检测细胞浆内的铁颗粒，发现标记率达到90％。SPIO 对标记细胞毒性低，细胞增殖不受影响。与未标记细胞相比，标记干细胞的细胞活性差异无统计学意义，与文献报道结果一致［14］。表明该方法是一种安全的方法，即使在移植后2周，也能通过MRI 监测到移植细胞的存活和分布状况。 MRI因其诸多优势在移植细胞定位、生存及迁移监测等领域成为研究热点， 超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)是干细胞MR示踪中应用最广泛的对比剂[15]。 SPIO标记干细胞的MR成像 目前多数干细胞研究采用组织学分析来评价细胞定位、存活数量、移植细胞的分化等。但组织学是有创检查，而且不能代表全部移植细胞的体内生存情况及其动态迁移[3]。干细胞移植的临床应用及相关科学研究需要合适的影像学方法对移植细胞在活体进行连续、无创的示踪观察[16]活体示踪移植干细胞的生存状态及迁移对阐明治疗效果的潜在机制及临床应用的实施有极其重要的作用。MR有良好的软组织及时间分辨率，无电离辐射，可以在示踪干细胞的同时评价干细胞移植的治疗效果，MR透视引导下精确移植定位的研究已见报道[17]。MRI因其诸多优势在活体干细胞监测领域成为研究热点。SPIO 对标记细胞毒性低，细胞增殖不受影响。与未标记细胞相比， 标记干细胞的细胞活性差异无统计学意义，与文献报道结果一致［18］。 参考文献 [1] 沈干，从笑倩，汪铮，吴春芳，曹谊林 小鼠胚胎干细胞建系及GFP标记东南大学学报.2003,Mar; 22( 2) : 71O74, 88 [ 2] M atuszew sk iL, Tom bach B, H eindelW, et al. M olecular and param e-tric im aging w ith iron oxides[ J] . Rad iologe, 2007, 47( 1) : 34- 42. [3] Frank JA, Miller BR, Arbab AS,et al. Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combining superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology. 2003;228(2):480-487. [4] Arbab AS, Bashaw LA, Miller BR, et al. Characterization of biophysical and metabolic properties of cells labeled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles and transfection agent for cellular MR imaging.Radiology. 2003;229(3):838-846. [5] Bos C, Delmas Y, Desmoulière A,et al. In vivo MR imaging of intravascularly injected magnetically labeled mesenchymal stem cells in rat kidney and liver.Radiology. 2004;233(3):781-789. [6] Kostura L, Kraitchman DL, Mackay AM,et al. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis but not adipoge