猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究.doc

****大学学士学位论文 摘要 本文主要讨论了以猪肝为原料对过氧化氢酶的提取条件进行了实验，以及对过氧化氢酶在牛奶保鲜方面的研究。根据猪肝过氧化氢酶在pH 5.3-8.0有活性，最适pH为7.0，溶于水的特性，采用水浸法提取猪肝过氧化氢酶，确定最佳提取条件，即：料、水质量比为1:5，浸取温度为25℃，浸取时间为8小时。同时测得猪肝过氧化氢酶Km值为0.029mol/L,并研究了过氧化氢酶在牛奶保鲜中的作用，发现过氧化氢酶能显著延长牛奶的保鲜期。 关键词：过氧化氢酶；猪肝；水浸法，Km值；牛奶保鲜 Title: Study on the Condition of Extraction of Catalase from Pig Liver and it’s Application Abstract： This article researched the extraction conditions of liver as the raw,and CAT in milk preservation research. The CAT possesses activity in pH 5.3~8.0 and dissolves to water,its optimum pH is 7.0.According to above properties,the method of lixiviating with water to extract CAT from pig liver was used.Frist choose the main factors,namely extraction time ,extraction temperature ,the ratio of pig liver to water,to acquire the most suitable combination conditions of extraction. The optimum extraction conditions of CAT from pig liver as follows:the ratio of pig liver to water is 1:5,extraction temperature is 25℃,ectraction time is 8 hours.Meanwhile, we measured the Km of catalase in the pig liver is 0.029mol/L,by studied the effect in milk preservation,we find that the catalase can prolong the preservation period obviously. Key words ：CAT； Pig liver ；water immersion ；Km；milk preservation 目录 第一章 绪论 1 1.1 什么是过氧化氢酶 1 1.2 过氧化氢酶的反应机理 1 1.3 过氧化氢酶在动植物机体中的作用 2 1.3.1 过氧化氢酶提高植物的抗逆水平 2 1.3.2过氧化氢酶提高植物光合作用能力 4 1.3.3过氧化氢酶增强植物的防御能力 5 1.3.4过氧化氢酶延缓植物衰老 5 1.3.5过氧化氢酶诱导植物细胞的全能性 5 1.3.6过氧化氢酶在控制植物细胞氧化还原平衡中的作用 5 1.4 过氧化氢酶的来源 6 1.4.1 最新动态－从细菌发酵中得到过氧化氢酶 6 1.5 过氧化氢酶的测定 7 1.6过氧化氢酶的用途 8 1.7过氧化氢的害处及其控制 8 1.8过氧化氢酶活性的研究 8 1.8.1 不同植物过氧化氢酶的活性 9 1.8.2 不同动物器官过氧化氢酶活性 9 1.9过氧化氢酶在棉针织物漂染工艺中的应用研究 9 1.9.1 影响过氧化氢酶除去织物中过氧化氢的因素 12 1.10 过氧化氢酶作为食品添加剂在牛奶保鲜方面的研究 13 1.11过氧化氢研究的最新进展和应用前景 14 1.12关于过氧化氢酶的Km值 15 第二章 实验部分 18 2.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件的研究 18 2.1.1 材料，药品与实验器材 18 2.1.2 浸取时间的选择 19 2.1.3 浸取温度的选择 19 2.1.4 料、水质量比的选择 20 2.1.5 正交试验设计 20 2.2 猪肝过氧化氢酶Km值的测定 21 2.2.1 实验原理 21 2.2.2 实验试剂 21 2.2.3 实验步骤 22 2.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜中的应用 22 2.3.1研究材料与方法 22 2.3.2检测标准 23 第三章 实验结果与讨论 24 3.1 猪肝过氧化氢酶浸取条件单因素实验结果与分析 24 3.1.1 浸取时间对猪肝过氧化氢酶浸出酶活的影响 24 3.1.2 浸取温度对过氧化氢酶浸出酶活的影响 25 3.1.3 料、水质量比对过氧化氢酶浸出酶活的影响 25 3.1.4 正交实验结果分析及最终浸取条件的确定 26 3.1.5 关于猪肝过氧化氢酶浸取条件的讨论 27 3.2 猪肝过氧化氢酶Km值计算 27 3.3 过氧化氢酶在牛奶保鲜应用中的结果与讨论 28 第四章 实验结果 30 致谢 31 参考文献 32 33 化学与生命科学学院－ － 生物技术专业 第一章 绪论 1.1 什么是过氧化氢酶 过氧化氢酶（CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。过氧化氢酶是一个同源四聚体，每一个亚基含有超过500个氨基酸残基；并且每个亚基的活性位点都含有一个卟啉血红素基团，用于催化过氧化氢的反应。 过氧化氢酶的最适pH接近7，最适温度则因物种而异。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。其催发反应式如下： 2H2O2 → 2H2O + O2 一个过氧化氢酶分子可以每秒钟将数百万个过氧化氢分子转化为水和氧气。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。 1.2 过氧化氢酶的反应机理 虽然过氧化氢酶完整的催化机制还没有完全被了解，但其催化过程被认为分为两步： H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E(.+) H2O2 + O=Fe(IV)-E(.+) → H2O + Fe(III)-E + O2 其中，“Fe()-E”表示结合在酶上的血红素基团（E）的中心铁原子(Fe)。Fe(IV)-E(.+)为Fe(V)-E的一种共振形式，即铁原子并没有完全氧化到+V价，而是从血红素上接受了一些“支持电子”。因而，反应式中的血红素也就表示为自由基阳离子(.+). 过氧化氢进入活性位点并与酶147位上的天冬酰胺残基（Asn147）和74位上的组氨酸残基（His74）相互作用，使得一个质子在氧原子间互相传递。自由的氧原子配位结合，生成水分子和Fe(IV)=O。Fe(IV)=O与第二个过氧化氢分子反应重新形成Fe(III)-E，并生成水分子和氧气。活性中心铁原子的反应活性可能由于357位上酪氨酸残基（Tyr357）的苯酚基侧链的存在（帮助Fe(III)氧化为Fe(IV)）而得以提高。反应的效率可能是通过His74和Asn147与反应中间体作用而得以提高。该反应的速率通常可以通过米氏方程来确定。 过氧化氢酶也能够氧化其他一些细胞毒性物质，如甲醛、甲酸、苯酚和乙醇等。任何重金属离子，（如硫酸铜中的铜离子）可以作为过氧化氢酶的非竞争性抑制剂。另外，剧毒性的氰化物是过氧化氢的竞争性抑制剂，可以紧密地结合到酶中的血红素上，阻止酶的催化反应。 1.3 过氧化氢酶在动植物机体中的作用 过氧化氢是一种代谢过程中产生的废物，它能够对机体产生损害。为了避免这种损害，过氧化氢必须快速地被转化为其他无害或毒性较小的物质。正如前面所说，过氧化氢酶就是常常被细胞用来催化过氧化氢分解的工具，从而不使机体发生H2O2中毒。 但是过氧化氢酶真正的生物学重要性并不是如此简单：研究者发现基因工程改造后的过氧化氢酶缺失的小鼠依然为正常表现型，这就表明过氧化氢酶只是在一些特定条件下才对动物是必不可少的。 一些人群体内的过氧化氢酶水平非常低，但也不显示出明显的病理反应，这很有可能是因为正常哺乳动物细胞内主要的过氧化氢清除剂是过氧化物还原酶（peroxiredoxin），而不是过氧化氢酶。 过氧化氢酶通常定位于一种被称为过氧化物酶体的细胞器中。植物细胞中的过氧化物酶体参与了光呼吸和共生性氮固定，但细胞被病原体感染时，过氧化氢可以被用作一种有效的抗微生物试剂，部分病原体，如结核杆菌，嗜肺军团菌和空肠弯曲菌，能够产生过氧化氢以降解过氧化氢，使得他们能在宿主体内存活。与过氧化氢酶相关的疾病有由过氧化氢酶功能缺陷所造成的过氧化物酶体异常（peroxisomal disorder）和过氧化物酶缺乏症（acatalasia）。 在投弹手甲虫中，过氧化氢酶具有独特用途。这种甲虫具有两套分开储存于腺体中的化学物，大的腺体中储存者对苯二酚和过氧化氢，而小腺体中储存着过氧化氢酶和辣根过氧化物酶，当甲虫将两个腺体中的化学物质混合在一起时，就会释放出氧气，而氧气既可以氧化对苯二酚又可以作为助推剂。 近年来，过氧化氢酶在植物体内的生理功能方面的研究取得了很多的进展，其主要有提高植物的抗逆水平、提高植物光合作用的能力、强植物的防御能力、延缓衰老、诱导细胞的全能性、在控制植物细胞氧化还原平衡中起重要作用[1]。 1.3.1 过氧化氢酶提高植物的抗逆水平 1） 抗干旱。Bailly等研究表明,干燥诱导使向日葵种子中过氧化氢酶活性增加,H2O2和脂质过氧化水平降低,说明过氧化氢酶保护种子免受脱水过程中产生的氧化损伤,也暗示H2O2可能在脱水信号传导中起作用,调节过氧化氢酶基因的表达；耐旱的干种子具有高的过氧化氢酶活性也说明其在耐旱中的作用。玉米等植物的过氧化氢酶活性在干旱条件下增加,但在恢复正常生长条件时,过氧化氢酶活性转为正常水平。转大肠杆菌过氧化氢酶基因的烟草,能抗除草剂百草枯,提高了在强光下的耐旱性及抗氧化胁迫的水平。研究还发现,用适量ABA(10～100mmol/ L)处理玉米苗促进H2O2的产生并明显提高SOD、CAT和APX等抗氧化酶的活性,增强对干旱等氧化胁迫的抵抗能力。 2）　增强耐盐能力。盐胁迫诱导过氧化氢酶活性的增加。Liang等研究盐敏感型和耐盐型大麦发现,用盐处理2d,显著刺激其根内SOD、POD和CATs活性的增加,但4d后则下降,若添加硅,则明显提高过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,增强耐盐性。用不同浓度的NaCl处理盐敏感和耐盐棉花,随着浓度的提高耐盐品种活性逐渐减低,而100 mmol/ L NaCl则使盐敏感品种CATs活性提高,说明耐盐品种本身具有较高的活性。反义表达过氧化氢酶的转基因烟草对盐胁迫更加敏感；盐胁迫下大麦等植物体内过氧化氢酶的活性明显增加,耐盐番茄(Lycopersicon pennellii)根部线粒体和过氧化物酶体H2O2和脂质过氧化水平低,而抗氧化酶活性如SOD、APX和CAT活性高。这些结果表明,植物高的抗盐能力与高水平的抗氧化酶密切相关。研究发现,一定浓度的氨基乙酰丙酸(52aminolevulinic acid2ALA)、γ2氨基丁酸(Gamma2aminobutyric acid)和外源GB (Glycinebetaine)能提高植物体内APXs和CATs的活性,增强对盐诱发的氧化胁迫的耐性过氧化氢酶。 3）　减轻重金属毒害。重金属