流式细胞术检测人和小鼠细胞内细胞因子方法的建立.doc

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群 早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。 由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。 淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。 材料与方法 试剂 PMA（Sigma） 贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃ 保存。 工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。 Ionomycin（Sigma） 贮存液：Ionomycin 溶于DMSO 浓度为1mg/ml -20℃ 保存。 工作液：贮存液1:20 稀释于RPMI 1640 培养基中，此时为50µg/ml。 GolgiStop（内含Monensin ，BD Pharmingen） Cytofix/Cytoperm液、Perm/Wash液和FACS Lysing Solution，均购自BD Pharmingen。 抗体 细胞表面标记抗体：抗人CD3-APC，CD8-PercP，CD8-CYC，CD4-CYC。抗小鼠CD4-CYC、CD8PE。 细胞内因子抗体：抗人IL-4-PE, IFN-γ-FITC。抗鼠IL-4-PE, IFN-γ-FITC。以上抗体均购自BD Pharmingen。 实验方法 1 外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。 2 不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10ul，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson)检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。 3 不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。 4 流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min， 使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5ul，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。 5 流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。 结果 1 不同浓度的PMA对人外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。10ng、20ng和50ng的PMA刺激后4h，CD4的表达明显下降，已经不能区分出CD4阳性T淋巴细胞，而CD8和CD3的表达未受明显影响。重复5次检测，典型的检测结果见图1。 2 不同时间的PMA刺激对小鼠外周血T淋巴细胞抗原表达的影响。PMA刺激8h后CD4阳性T淋巴细胞的表达没有明显下降。PMA刺激12h后，CD4阳性T淋巴细胞的表达明显下降。而CD8表达在8h和12h均没有明显下降。典型的检测结果见图2。 3 正常人外周血Th1细胞和Th2细胞。采用CD3+CD8-的T淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞（IL-4+）的百分比。典型检测结果见图3。 4 正常Balb/c小鼠外周血Th1细胞和Th2细胞。采用CD4＋淋巴细胞为Th细胞，设门分析Th1细胞（IFN-γ+）和Th2细胞的百分比（IL-4+）。典型检测结果见图4。 讨论 从Rostaing等[2]发表流式细胞术检细胞内细胞因子的方法后，陆续有人研究了流式细胞术检测细胞内因子方法的可行性及重复性等问题。虽然活化T淋巴细胞有各种各样的方法，如：PMA、PHA、Con A、CD3、CD2和CD28等。但是目前公认的较好的方法仍然是PMA和钙离子载体的联合刺激。研究发现在PMA的刺激后4h，IFN-γ和IL-4的表达就达到一个较高的水平，因而适合进行流式检测。我们的研究结果发现，人的外周血T淋巴细胞表面的CD4表达受PMA的影响非常大，在刺激后2h即明显下降，4h已经难于区分CD4阳性T淋巴细胞，因此这就难于确定Th细胞。虽然国内部分学者认为在PMA的刺激下，CD4仍可以维持一定的表达[3,4]，但是我们的结果和国内部分[5]及国外的大多数[2,6]研究结果表明，在PMA的刺激下，CD4表达迅速下调，此时采用CD4来标记Th细胞已经不能准确的检测Th细胞，因而不能准确的反应Th1和Th2细胞的比率。而CD3和CD8的表达受PMA等刺激因子的影响很小，因此，目前，国外推荐的方法是采用CD3和CD8设门，区分CD4阳性T淋巴细胞。由于多色荧光标记流式检测技术的发展，笔者认为采用4色标记技术检测人Th细胞是目前最好的方法。这种方法可以实现一个检测管，同时观察Th1细胞和Th2细胞；可以检测CD8＋细胞的细胞内因子的表达；还可以观察IL-4和IFN-γ双阳性细胞。一个检测管同时染色，节约了抗体和劳动量等检测成本。但是由于多色染色技术对流式的操作者有较高的要求，实施过程要注意补偿调节等具体问题，我们曾经采用CYC标记的CD8和APC标记的CD3联合设门区分Th细胞，由于CYC和APC在BD公司的流式细胞仪上，仪器的补偿调节非常困难，最终放弃该方法，改用PerCP标记的CD8才解决这一问题。目前，国内一些流式细胞仪型号相对落后，不能进行4色染色标记技术，笔者认为可以采用双管标记检测法，即采用CD3、CD8和IFN-γ3色标记一管用于检测Th1细胞；采用CD3、CD8和IL-4 3色标记一管用于检测Th2细胞。采用这种方法的缺陷是每个样品检测管数增加，造成检测成本增高，而且不能同时观察IL－4和IFN-γ双阳性细胞。国外有报道采用IFN-γ、IL-4和CD3进行3色标记[7]，这种方法只能观察T淋巴细胞表达的细胞因子的变化，不能区分CD4＋和CD8＋细胞，笔者认为是一种不可取的方法。 我们在Balb/c小鼠实验发现在PMA的刺激下，CD4表达虽然下调，但是其表达持续时间比人的持续时间明显增长，在刺激8h后，仍然能维持一个较高的水平，因而能够有效的区分Th细胞。因此，在Balb/c小鼠采用CD4和IFN-γ、IL-4进行3色标记技术就能有效的检测Th细胞亚群。当然由于CD3和CD8的表达受PMA的影响很小，采用CD3、CD8和IFN-γ、IL-4进行4色标记技术也非常有效。另外，由于CD4不仅在T细胞上表达，还在单核细胞上表达，单独用CD4设门容易受单核细胞的干扰，解决这个问题的一个办法就是采用FSC和SSC散点图来设门区分单核细胞和淋巴细胞，采用CD4直方图区分CD4阴性和阳性细胞，最后采用既位于淋巴细胞区，有位于CD4＋区的细胞来定义为Th细胞，这样可以有效的避免单核细胞的干扰。当然采用4色标记也是一种非常有效的避免单核细胞干扰的方法。 由于T淋巴细胞表达的因子非常多，检测其它细胞因子可以参照检测IL-4和IFN-γ的方法进行。凡是采用PMA等作为刺激剂的检测方法均应考虑到PMA等刺激剂对于细胞表面抗原表达的影响，从而选择最佳的荧光抗体标记，这是进行准确的检测的基础。 参考文献 1. Mosmann TR, Cherwinski H, Bond BW, Gieldlin MA, Coffman RL. Twotypes of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokines activ