流式细胞仪原理及操作步骤.doc

流式细胞仪原理及操作步骤 流式细胞仪(FCM)是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的 结果。 　　(一)　原理 　　活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。 　　(二)　操作步骤 　　　　　制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 　　　　　胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640调整细胞浓度为 　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 　　　　　　　　的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 　　　　　　　　稀释)灭活正常兔血清 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min 　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 　　　　　　　　　(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min 　　　　　　　　　用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 　　　　　　　　　视细胞浓度加入100～500μl固定液) 　　　　　　　　　　　　　　　　　↓ 　　　　　　　　　FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 　　　　　　　　　　(标本在试管中可保存5～7天) 　　(三)　试剂和器材 　　1.　各种特异性单克隆抗体。 　　2.　荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 　　4.　玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 　　(四)　注意事项 　　1.　整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 　　2.　洗涤要充分，红外碳硫仪以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 　　3.　加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 　　4.　细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 　　附: 　　1. DPBS (×10, 贮存液) 　　　　NaCl 80g 　　　　KCl 2g 　　　　　蒸馏水加至1000ml 　　　　Na２HPO４ 11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释 　　　　KH２PO４ 2g 　　2.　洗涤液 　　　　DPBS　　　　　　900ml 　　　　FCS 50ml (终浓度　5％) 　　　　4％NaN３　　　50ml (终浓度0.2％) 　　3.　固定液 　　　　DPBS　　　　1000ml 　　　　葡萄糖　　　　20g (终浓度2％) 　　　　甲　醛　　　　10ml 　　　　NaN３　　　0.2g (终浓度0.02％)