第二节流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记以及细胞凋亡检测样品的制备。知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下：(1)每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性对照样品。(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，一般在室温下反应15～30min即可。(4)加入500μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30min。(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800～1000r/min，5min)。(3)用100μlPBS重悬细胞，再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30min。(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500μlPBS重悬成单细胞悬液，上机检测。注意：以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间，没有非常具体的规定，一般应根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可保存5d。3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。下面主要介绍与流式细胞仪配套的QPREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100μl置12mm×75mm专用塑料试管中；②每份加入20μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性对照，室温下避光染色15min；③置QPREP仪上溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5min；④上流式细胞仪检测。(2)微量全血间接荧光染色法：具体方法为①取肝素或EDTA抗凝全血100μl置12×75mm专用塑料试管中；②加入50μl特异的第一单克隆抗体，室温下孵育30min；③置QPREP仪上溶解红细胞，稳定和固定白细胞；④离心(800～1000rpm，5min)弃上清液，用PBS洗涤细胞2次...
