毕业论文：鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验.doc

河　南　科　技　学　院 2013届本科毕业论文（设计） 鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验 学生姓名： 时 科 所在院（系）： 动物科学学院 所学专业： 动物医学 导师姓名： 常 新 耀 完成时间： 2013年5月 鸡大肠杆菌病病原的分离与鉴定及药敏试验 摘 要 鸡大肠杆菌感染是危害养鸡业的主要细菌性传染病，无菌采取南阳市唐河县某鸡场中疑似大肠杆菌病死雏鸡肝、脾、肺等脏器病料，通过结合综合流行病学、临床学、病理学、生物化学和传染病学，进行分离与鉴定，最终确诊为鸡大肠杆菌病。从部分养鸡场分离出的细菌进行药敏试验，通过药敏试验筛选出敏感药物，为治疗与预防提供理论依据和实际应用参数。 关键词：大肠杆菌，分离，鉴定，药敏试验 The Separation,Identification And Antimicrobial Susceptibility Test Of Chicken Colibacillosis Abstract Chicken colibacillosis infection is the major infectious diseases in poultry industry. Sterilely resorting to visceral organs, such as livers ,spleens, lungs of illness, chicklings that are suspected colibacillosis of each large chicken places in Shanxian,by the means of combing with epidemiology,clinical, pathology, biochemistry and epidemiology,we can separate and identificate to diagnose whether it is colibacillosis or not. By the means of form dyeing and Biochemical tests and then antimicrobial susceptibility test on bacterium that is separated from part chicken places,we can screen some Sensitive drugs and find more effective proprietary to Provide theoretical basis and practical parameters of treatment and prevention. Key words: Colibacillosis，Separation，Identification，Antimicrobial Susceptibility Test 目 录 前 言 1 1 材料与方法 1 1.1 材料 1 1.1.1　病料来源 1 1.1.2　仪器及设备 1 1.1.3　培养基与试剂 1 1.1.4 试验动物 2 1.2 试验方法 2 1.2.1　病理剖检 2 1.2.2　大肠杆菌的分离鉴定 2 1.2.3　病料采集 2 1.2.4　分离培养 2 1.2.5　镜检 2 1.2.6　生化鉴定 3 1.2.7　致病性试验 3 1.2.7　药敏试验 3 2　结果与分析 3 2.1　病理剖检 3 2.2　大肠杆菌的分离培养 4 2.3　形态学观察 4 2.4　生化鉴定 4 2.5　致病性试验 5 2.6　药敏试验 5 3　讨论 6 3.1　注意种蛋卫生 6 3.2　加强卫生管理 6 3.3　适当添加维生素和微生态制剂，增强机体抵抗力 7 3.4　免疫预防接种 7 4　结论 7 参考文献 8 致　谢 9 前 言 鸡大肠杆菌病是由大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli，E.coli)某些血清型菌株引起的一类疾病的总称[1]。　 大肠杆菌致病性菌株的致病因子主要由该病原体的三个特征所决定：侵袭力，感染力，致病性潜力。该菌主要有三个原类型，即菌体抗原，表面抗原，鞭毛抗原。该菌对外界的抵抗能力不强，一般60℃15min便可致死，对一般消毒药的抵抗力也很弱，但常用的消毒药水均能将其杀死[2]。　 大肠杆菌病可以引起胚胎死亡、脐炎、败血症、肉芽肿、全眼球炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎等一系列病症，是家禽中最常见的病原菌之一[3]。由于该病在一些养殖场中严重发生，兽医临床上抗菌药物不得不大量地被应用，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环；同时加剧了抗菌药物在畜禽体内的残留，给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害[4]。　 随着唐河县养鸡业的迅速发展与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌已成为鸡群中重要疾病之一。2012年12月，唐河六和饲料公司合作某鸡场所饲养的鸡于24天开始发病，两天之内，死亡21只。病鸡多精神沉郁，食欲减退，腹部膨大，粪便呈灰绿色或黄色，本实验室对送检的病鸡48只，病死鸡进行了剖检、病理学诊断和病原检测，确诊该鸡场发生了大肠杆菌病，筛选出对这些致病菌比较敏感的几种药物进行治疗，控制疫情。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1　病料来源 所有病料来自于唐河六和饲料公司合作某鸡场提供的病鸡，初步确诊为大肠杆菌病，病鸡48只，其中死亡35只，死亡鸡死亡时间不超过24h，其中肉仔鸡、蛋雏鸡27只，产蛋鸡21只。　 1.1.2　仪器及设备 光学显微镜、恒温箱、高压灭菌器、无菌实验台、微量移液器等（由南阳市唐河六和化验室提供）。　 1.1.3　培养基与试剂 麦康凯琼脂（NA）、伊红美兰琼脂、普通肉汤、营养琼脂（NA）验所用的培养基均参照《兽医微生物实验指导》制备。　 硝酸盐还原剂、氧化酶试剂、微量生化试验管（购于上海睿智化学研究有限公司）、药敏纸片购自南阳市畜牧兽医站(上海市医学化验所试剂厂生产) 1.1.4 试验动物 小白鼠（购于南阳畜牧兽医站）和各日龄健康鸡（购自唐河县分散养殖场） 1.2 试验方法 1.2.1　病理剖检 对送检的35只病死鸡进行了病理剖检及大体病变的观察。 1.2.2　大肠杆菌的分离鉴定 样品 ↓ 在各种培养基上划线分离(置37℃培养24h) ↓ 菌落形成 ↓ ————————————————————— ↓ ↓ ↓ 挑取菌落染色镜检 纯培养 培养特性检查 ———————————————————————————— ↓ ↓ ↓ ↓ 染色镜检 生化试验 致病力测定 药敏试验 1.2.3　病料采集 采集鸡场病死鸡各一只，无菌取心脏和肝脏。注射器自心脏采血1ml用于细菌分离培养，用灭菌后的外科手术刀片烧烙脏被膜后，再用接种环刺入肝实质取肝样做分离培养。 1.2.4　分离培养 以无菌操作的方法，将采取的病料，分别接种在普通琼脂平板、麦康凯琼脂、伊红美兰琼脂，37℃恒温培养24h，然后观察。挑取表面光滑、边缘整齐、灰白色、半透明的单个微隆起小菌落，划线接种于肉汤中，在37℃恒温培养24h[5]。 1.2.5　镜检 挑取麦康凯琼脂平板上培养2O h的新鲜菌落,光滑、砖红色的单个菌落涂片，将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脱色约15～30s,直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；滴加番红染液，复染1min，水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色[6]，观察记录菌体形态和染色特征。 1.2.6　生化鉴定 a、糖发酵试验 取可疑菌分别接种葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖发酵管，37℃培养2～3d，观察结果。 b、MR（甲基红）试验和VP（乙酰甲基甲醇试验）试验 取可疑菌接种葡萄糖蛋白胨水，37℃培养2～3d，分别加入MR和VP指示剂，观察结果。 c、吲哚试验 取蛋白胨水培养管先加少量乙醚，塞紧棉塞振摇试管，使蛋白胨水培养液与乙醚充分混匀，放于试管架上静置片刻，待乙醚漂浮于液面上层时，沿管壁滴加吲哚试剂2～3滴，观察其颜色变化[7]。 1.2.7　致病性试验 动物试验将分离菌接种于营养肉汤，于37℃恒温培养箱中培养24h。取健康小白鼠6只，分为A、B两组， A组3只，腹腔接种营养肉汤菌液，每只0.2mL；B组3只，腹腔接种等量的灭菌生理盐水作对照组，分别隔离饲养观察。 取6只7日龄雏鸡，健康，也随机分为C、D两组，与小白鼠同样的方法，C组皮下接种营养肉汤菌液，每只0.2mL；D组接种等量的灭菌生理盐水，隔离饲养。 1.2.7　药敏试验 药敏纸片购于南阳市唐河县畜牧兽医站(上海市医学化验所试剂厂生产)，选取不同地区的分离株6株进行药敏试验。在无菌条件下将培养24h的肉汤培养物，用灭菌生理盐水作10倍稀释，取0.2mL滴加在普通琼脂平板培养基上，用灭菌棒涂匀，平板置室温下干燥3～5min，用无菌镊子将卡那霉素、新霉素、庆大霉素、呋喃妥因、 四环素、链霉素6种药物的含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距大于20mm，纸片距平板内缘大于15mm[8]；置35℃恒温箱内16～18h后，观察结果。 2　结果与分析 2.1　病理剖检 剖检时可闻到特殊臭味，见病鸡胸腔、腹腔内有大量黄色干酪样渗出物腹腔内大块黄色块状渗出物；肝脏肿大，表面瘀血，有散在的白色小坏死灶；纤维性心包炎，心包浑浊增厚，心包腔内充满大量淡黄色液体，心包膜及心外膜上有白色纤维蛋白附着，严重者可见心包膜与心外膜粘连；肺脏瘀血，表面的纤维性渗出物明显；肠黏膜弥漫性出血，整个肠管呈紫红色；肾脏体积肿大，呈紫红色，肾脏出血，水肿，质脆，一触即烂。 2.2　大肠杆菌的分离培养 麦康凯琼脂上形成红色、圆形隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为1.5～2.5毫米的小菌落（见图1）；在伊红美蓝琼脂上形成紫黑色、具有金属光泽的小菌落（见图2）；在普通琼脂斜面上形成灰白色的菌落；在普通肉汤中呈现均匀浑浊，管底形成灰白色沉淀，并有粪臭味。 图1 麦康凯琼脂 图2　伊红美蓝琼脂 2.3　形态学观察 经镜检可见到革兰氏阴性菌，两端钝圆，有长约1.5～3.O微米的短小杆菌，偶有2～3个菌体相连，无芽孢。（见图3） 图3　镜检结果 2.4　生化鉴定 将分离到的菌株，经生化试验鉴定，分解葡萄糖、麦芽糖、甘露醇产酸产气，不分解蔗糖,MR试验呈阳性，VP试验为阴性，吲哚试验阳性,硝酸盐试验阳性，枸橼酸盐试验阴性，硫化氰试验阴性。此结果符合大肠杆菌的特征，见表1。 表1　分离菌生化试验结果 生化试剂  生化试剂  乳糖 ⊕ 枸橼酸盐 — 葡萄糖 ⊕ VP试验 — 甘露醇 ⊕ 靛基质 + 麦芽糖 ⊕ MR试验 + 蔗糖  — 硫化氢 — 阿拉伯糖 — 尿素酶 — 山梨醇 — 吲哚 + 硝酸盐 + 注：+表示阳性；一表示阴性； 表示阳性并产气[9]。 2.5　致病性试验 小白鼠试验结果：接种36h内A组小白鼠全部死亡，解剖可见肝脏肿大、出血和灰白色坏死灶，脾脏瘀血肿胀等明显病理变化，从死亡小白鼠的肝、心、脾等病料中均能回收到接种菌；B组小白鼠饲养1周后全部存活，剖检无病理变化。 雏鸡试验结果：接种1周后，C组雏鸡全部死亡，取