2023年突变生物合成在微生物药物领域的研究进展.doc

突变生物合成在微生物药物领域的研究进展 【】　突变生物合成作为产生抗生素衍生物的重要手段，自20世纪70年代兴起以来，发挥了巨大作用，已开发出许多至今在临床上仍广泛使用的抗生素品种。随着基因技术的开展，突变生物合成技术可直接对次级代谢途径中一特定酶基因进行改造获得突变株，大大提高了工作效率和准确性。本文综述了突变生物合成技术在微生物药物领域的应用，特别是结合基因技术进行突变生物合成研究的新进展。 【关键词】 微生物药物 　　Review on mutational biosynthesis in microbial medicinal fields ABSTRACT Mutational biosynthesis since its rising in1970′s，as a tool for the formation of antibiotic structural analogues，has played an important role and developed some novel derivatives which are still widely used in the clinic today.With the advance of gene engineering，mutants can be obtained by direct gene modifi-cation to certain enzyme in secondary metabolism pathway and efficiency is greatly promoted.In this paper，the progress，especially combining gene engineering of mutational biosynthesis is reviewed. KEY WORDS Mutational biosynthesis〔MBS〕; Mutasynthon; Blocked mutant; Antibiotics 新疾病的产生和耐药菌的出现，迫切呼唤新的生物活性物质的开发。人们主要从三个途径获得新的活性物质:①自然界;②化学合成以及化学改造;③对产生菌的次级代谢途径进行改造，使其合成途径发生改变，以获得新化合物，主要包括突变生物合成〔muta-tional biosynthesis，MBS〕和前体定向生物合成〔pre-cursor directed biosynthesis，PDB〕。尽管前两种方式在新药开发过程中仍然占主导地位，但后者特别是MBS也为一种十分有效的途径，且显示出巨大的潜力。 MBS是指抗生素产生菌经过物理、化学等诱变因素的作用或通过基因改造，生物合成途径中的某一位点发生突变，丧失合成完整抗生素分子的能力而成为阻断突变株。在发酵培养这种阻断突变株时，添加某种天然的或化学合成的化合物——突变合成元〔muta- synthon〕参与生物合成并获得新抗生素的方法和过程。广义的MBS还包括利用生物合成途径改变获得原抗生素的代谢产物和利用阻断突变株积累一些原始菌株所不能积累的抗生素中间体。 1969年，Shier用MBS方法对新霉素进行结构改造。1975年，Nagaoka等用“idiotroph〞——独需型〔特需型〕来描绘那些需要参加外源前体完成新衍生物合成的突变株，并用“mutational biosynthesis〞——突变生物合成来描绘这种技术。1977年Rinehart将这种技术定义为“mutasysthesis〞。按照Rinehart的解释，利用MBS技术制备新衍生物应包括:①突变株的获得;②突变合成元的获得;③添加的突变合成元被细胞吸收并参与新衍生物合成。此外，后续工作还应包括新衍生物的别离和结构鉴定，以及生物活性评价。 本文按结构类别介绍MBS技术在微生物药物领域的研究应用，特别是近年来结合基因技术进行MBS研究的新进展。 　1 突变生物合成在氨基糖苷类抗生素中的应用1～5］ 　氨基糖苷类抗生素是临床上重要的抗感染药物，但存在一定程度的肾、耳毒性。因此，对已有品种进行改造，开发对耐药菌有效、肾〔耳〕毒性相对较小的新品种一直是新药研究人员追寻的目标。20世纪70年代，人们利用MBS技术对氨基糖苷类抗生素进行改造，获得成功，特别是涉及2-脱氧链霉胺〔2-deoxystrepta-mine，DOS〕独需型阻断突变株的研究。如Rosi等通过诱变获得庆大霉素产生菌绛红色小单孢菌〔Micromo-nospora purpurea〕D-突变株后，添加链霉胺，生成2-羟基-庆大霉素，该化合物对含有2〞-腺苷腺化酶的庆大霉素耐药菌有较强活性，毒性低，在临床上被广泛使用。这方面的研究Rinehart等曾进行过总结，本文不做详细表达。 值得提出的是，20世纪80年代赵敏等通过诱变获得a位点〔Fig.1〕阻断的突变株JIM-401，该突变株代谢产物中庆大霉素C 2b 〔GM C2b 〕组分即小诺米星的产量大大提高，并实现工业化生产;再以JIM-401为出发菌株，获得c位点阻断的突变株JIM-202，该突变株的代谢产物中庆大霉素C1a 〔GM C 1a 〕的积累量大大增加〔含量在85%以上〕，在其2-脱氧链霉胺1-N位引入一个乙基，经半合成获得新化合物1-N-乙基庆大霉素C1a 〔etimicin，依替米星〕;再以JIM-202为出发菌 株，获得b位点阻断的突变株JIM121，其代谢产物中 西索米星〔sisomicin〕组分的产量大大增加。 目前，丁酰苷菌素、卡那霉素、庆大霉素、妥布霉素、新霉素、链霉素等氨基糖苷类抗生素的生物合成基因簇的研究取得了可喜的成就，这为利用MBS方法结合现代基因技术对氨基糖苷类抗生素进行改造提供了有利条件。 2 核苷类抗生素的MBS研究［6，7］ Nikkomycin是唐德链霉菌〔Streptomyces tendae〕Tü901产生的一种核苷肽类抗生素，与几丁质合成酶底物UDP-N-乙酰葡萄糖胺有类似结构，竞争性抑制几丁质合成酶，干扰真菌细胞壁的合成，是一种低毒的抗真菌及杀虫剂。 尿嘧啶和4-甲酰基-4-咪唑啉-2-酮是nikkomycin生物合成途径中的两个中间体，分别对应Z和X组分。1984年，Delzer等通过诱变获得pyr - 突变株。该突变株不能合成以尿嘧啶为中间体的nikkomycin。添加23种N-杂环化合物进行MBS研究，其中胸腺嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶和5-氟尿嘧啶可被利用合成新的衍生物。 1999年，Bormann等采用基因工程方法进行MBS的研究，构建了L-赖氨酸-2-氨基转移酶失活突变株S.tendae nikC，该突变株不能合成nikkomycin I，J，X，Z肽基侧链的前体哌啶-2-羧酸，积累了nikkomycin的核苷成分。当添加吡啶甲酸时，可恢复产生nikkomycin I，J，X，Z;添加苯甲酸，获得Bx和Bz组分〔如Fig.2所示〕。Bx和Bz比X，Z有较高的pH稳定性，Bx对白念珠菌有更高的抑菌活性。 此外，Bormann等还构建了产nikkomycin LX 和L 的突变株，获得的新衍生物也显示出很好的抗菌活性。目前，nikkomycin产生菌分子生物学特性的研究已经取得了巨大的成就，通过MBS技术并结合基因手段，相信会有更多更优质的产品出现。 　3 Clorobiocin的MBS研究［8，9］ Clorobiocin、新生霉素〔novobiocin〕和coumer-mycin〔香豆霉素〕是由链霉菌产生的一类具有抑制 DNA旋转酶活性的抗生素，同属于氨基香豆素家族， Fig.2 MBS of nikkomycin 能够与细菌DNA旋转酶B亚基紧密结合，有效抑制该酶活性，实现抗菌作用。对氨基香豆素类抗生素的研究主要集中在clorobiocin和新生霉素，两者的结构如Fig.3所示，包括三个局部:ring A，3-异戊烯基-4-羟基-苯甲酰〔3-prenyl-4-hydroxybenzoyl，DMAHB〕;ring B，3-氨基-4，7-二羟基香豆素〔3-amino-4，7-dihy-droxycoumarin，ADHC〕;ring C，诺维糖〔L-noviose〕。2023年Galm等通过基因手段构建了clorobiocin产生菌异戊烯基转移酶失活突变株——cloQ - 。该突变株不能合成DMAHB前体。添加DMAHB类似物〔如Fig.4所示〕获得了28种clorobiocin衍生物。体外活性研究发现，新衍生物对大肠埃希菌DNA旋转酶抑制活性是新生霉素的50%～200%，但即使是活性最高的衍生物，其活性仅为clorobiocin的50%;对枯草芽孢杆菌ATCC14893的生长抑制活性比新生霉素和clorobiocin都低;大局部新衍生物对葡萄球菌均有效。 　　4 糖肽类抗生素的MBS研究 　　活性与万古霉素相当，但对厌氧菌尤其是梭状芽孢杆菌的抑制活性要高得多。因此，balhimycin具有很好的临床价值。 目前，对balhimycin等糖肽类抗生素的结构改造研究主要集中在非蛋白组成氨基酸，如β-羟基酪氨酸〔Hty〕、3，5-二羟基苯基甘氨酸〔Dpg〕和4-羟基苯基甘氨酸〔Hpg〕等。 2023年，Pek等第一次用MBS技术对balhimycin进行研究〔Fig.6a〕，删除过氧化氢酶基因bhp的一段序列，获得Hty合成阻断突变株。添加Hty，修复bal-himycin生产能力;添加外消旋3-氟-β-羟基酪氨酸合成了fluorobalhimycin;添加2-氟，3，5-二氟-β-羟基酪氨酸也合成了相应的fluorobalhimycins;D/L-酪氨酸以及酪氨酸酚羟基被氟取代或位置改变的类似物，未能掺入到新衍生物的合成，说明酚羟基的重要性。活性研究说明，所有的氟化balhimycin衍生物对枯草芽孢杆菌都有抑制活性。 2023年，Weist等删除Dpg编码基因dpgA的一段序列，获得Dpg合成阻断突变株。添加Dpg，修复balhimycin生产能力;添加4种单、双取代羟基、甲氧基的Dpg类似物〔Fig.6b〕均获得了新衍生物;通过添加实验，Weist等共获得20多种糖基化方式不同的衍生物。有趣的是，添加3-单取代-苯基甘氨酸，合成的新衍生物有一局部在7位Dpg和5位Hpg间缺少正常balhimycin的AB-环联芳键。 CDA CDA〔calcium-dependent antibiotic〕是由天蓝色链霉菌〔Streptomyces coelicolor〕A3产生的酸性脂肽类抗生素，其结构与达托霉素〔daptomycin〕类似，分子中有许多D-氨基酸和非蛋白组成氨基酸，与免疫抑制剂环孢菌素、抗肿瘤药物博来霉素和抗菌药物万古霉素同属于非核糖体合成肽〔nonribosomal peptides〕家族。CDA的结构如Fig.7所示，根据R 6 、R 9 、R10 和R 11 上取代基的不同，分为CD A 1b 、CD A 2b 、CD A 3b 、CD A4b 、CD A 2a 、CD A 4a 等组分。英国曼彻斯特理工 大学〔UMIST〕和Sanger研究所对CDA基因簇结构研究结果显示，82Kb的基因簇序列包含了至少40个开放阅读框〔SCO3210-SCO3249〕，并利用分子手段结合现代别离检测技术对各阅读框的功能和CDA的生物合成途径进行了研究和推理。 2023年，Hojati等利用分子生物学手段获得4-羟基-苯乙醇酸合成酶基因hmaS〔SCO3229〕被破坏的突变株，该突变株不能合成CDA分子重要的结构单元4-羟基-苯基甘氨酸〔Hpg〕。添加外消旋4-羟基-苯乙醇酸或4-羟基-苯乙醛酸或L-Hpg可恢复CDA的生产能力;添