时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析.doc

时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎血清标志物分析灵敏度的建立与分析 Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay 谭玉华 陈鲜美 卢顺舵 沈 健 （广州市丰华生物工程有限公司，广东 广州 510730） 摘 要 对乙型肝炎表面抗原和表面抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行建立与分析，以便更好的指导临床诊断和进行流行病学研究。通过实验研究，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒和表面抗体定量检测试剂盒的检测低限分别为0.0356ng/mL和0.548 mIU/mL，生物检测限分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，功能灵敏度分别为0.200 ng/mL和5.00 mIU/mL，线性范围分别为0.200 ng/mL-300 ng/mL和5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL，并达到中国药品生物制品检定所检定要求。时间分辨荧光免疫分析法乙型肝炎病毒定量检测试剂盒具有灵敏度高，线性范围宽，特异性强的特点，已能有效应用于临床体外诊断和流行病学研究。 关键词 时间分辨荧光免疫分析；乙型肝炎；标志物；分析灵敏 Establishment and analysis of analytic sensitivity of hepatitis B virus serum markers by Time-resolved Fluoroimmunoassay TAN Yu-hua,CHEN Xian-mei,LU Shun-duo,et al. Guangzhou Fenghua Bio-engineering Co.,LTD,Guangzhou 510730 China Abstract To establish and analyse the analytic sensitivity for the quantification kits for hepatitis B virus(HBV) surface antigen(HBsAg) and antibody to HBsAg (anti-HBs),the kits were measured by Time-resolved Fluoroimmunoassay(TRFIA),in order to the better instruction clinical diagnosis and conducts the epidemiology research. Through the study,the lower limit of detection of the quantification kits for HBsAg and anti-HBs for 0.0356ng/mL and 0.548 mIU/mL respectively, the biological limit of detection is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the function sensitivity is 0.200 ng/mL and 5.00 mIU/mL respectively, the linear scope is 0.200 ng/mL-300 ng/mL and 5.00 mIU/mL-1200 mIU/mL respectively, and passed the examination of the National Institute for Control of Pharmaceutical and Biological Products. The quantification kits for HBV serum markers by TRFIA ,which has the high sensitivity, the wide linear scope,the good specificity,could have the effect to use in the clinical in vitro diagnosis and the epidemiology research. Key words Time-resolved Fluoroimmunoassay; Hepatitis B virus;Marker;Analytic sensitivity 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的检出是乙型肝炎病毒（HBV）感染的金标准。乙型肝炎病毒表面抗体（抗-HBs）是对HBV具有保护性的免疫指标，它的检出有助于乙型肝炎（简称：乙肝）的预防与接种。随着时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）在定量检测HBsAg和抗-HBs中的应用，对HBsAg和抗-HBs的分析灵敏度有了进一步提高，并且定量结果取代了定性报告，为临床诊断提供了更多的信息。在实验室，对试剂盒和方法学有必要建立自己的可定量报告的生物检测限或对试剂盒和方法学说明的检测限进行确认[1-2]，以便更好的指导临床的诊断。作者在此对乙型肝炎HBsAg和抗-HBs定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法）的分析灵敏度进行了建立与分析。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 高浓度HBsAg和抗-HBs血清各5.00mL，乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒（国药准字S20050108）和表面抗体定量测定试剂盒（国药准字S20050110）（时间分辨荧光免疫分析法），以及DEM-III自动酶标洗板机和FWZ-I振荡仪均由广州市丰华生物工程有限公司提供。“检测HBsAg血清Panel国家参考品”（批准文号：[91]卫生参字0003）和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”（批准文号：[91]卫生参字0004）购于中国药品生物制品检定所。VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER（时间分辨荧光免疫检测仪）为Wallac产品。 1.2 方法 采用试剂盒0标准品为空白液（BLANK），将高浓度HBsAg和抗-HBs血清加入空白液做系列稀释，组成0.000ng/mL、0.200 ng/mL、0.500 ng/mL、1.00ng/mL、2.00ng/mL和5.00 ng/mL的HBsAg系列检测限品，以及0.000mIU/mL、5.00mIU/mL、10.0mIU/mL、20.0mIU/mL、30.0 mIU/mL和40.0 mIU/mL的抗-HBs系列检测限品。并将高浓度HBsAg和抗-HBs血清分别用空白液按一定比例稀释，各配得线性检测品。各用三批试剂测定“检测HBsAg血清Panel国家参考品”和“检测抗-HBs血清Panel国家参考品”，同时做标准曲线。HBsAg采用双抗体夹心法，抗-HBs采用双抗原夹心法，均按试剂盒说明书严格操作。空白样品做20次批内重复测定；对其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。实验均在VICTOR2TMD 1420 MULTILABEL COUNTER上测定荧光值（RF值）。收集数据，按文献[3]的方法分析TRFIA 法HBsAg和抗-HBs定量检测试剂盒的检测低限（LLD）、生物检测限（BLD）、及功能灵敏度（FS），参考文献[4]及血清Panel国家参考品说明书对试剂盒进行检定。 2 结果 2.1 分析灵敏度 空白样品做20次批内重复测定，其它系列检测限品做天间重复测定，共连续做20天。其系列检测限品的RF值检测结果详见表1。 表1 乙型肝炎表面抗原和表面抗体系列检测限品的荧光值检测结果 HBsAg（ng/mL） 0.000 0.200 0.500 1.00 2.00 5.00 抗-HBs（mIU/mL） 0.000 5.00 10.0 20.0 30.0 40.0 荧光值 1633 3348 5631 10012 17291 41064 1680 5556 8431 15687 21148 30837 1533 3413 5513 10467 17581 39757 1432 4573 7575 14897 21475 34700 1531 3528 6122 9676 17033 38015 1513 5524 9817 19904 28048 40068 1491 3564 5682 9863 17343 38165 1548 6951 8710 19352 28842 37691 1341 3244 5593 10089 17872 43463 1387 6680 8976 19765 29942 39438 1323 3342 5366 12011 19000 42757 1507 6364 9398 21100 30173 37480 1368 3390 5216 9788 15650 34988 1491 4828 8203 14884 21327 30372 1429 3344 5650 10031 13658 32543 1438 4839 7078 21327 21511 31768 1568 3269 5294 9229 17106 37854 1453 5982 9473 21818 30211 38842 1694 3217 5719 9495 15873 35898 1537 6397 9096 20755 29400 35215 1486 3742 6111 12882 18023 41683 1565 4691 7946 20640 30406 40363 1360 3739 7493 10442 18826 40926 1654 5336 7919 20793 30447 40290 1464 3923 6356 12242 18878 43489 1744 4877 7255 15315 25061 35287 13